Biogeografie protist

Metody studia biogeografie protistních organismů

Ke studiu biogeografie protistních organismů, jakožto součásti mikrobiální ekologie, je nutné přistupovat poměrně komplexním způsobem a výsledná data by měla být syntézou výsledků z různých oborů (Obr. 11.1.).

Obr. 11.1. Propojení mikrobiální ekologie s dalšími vědními obory (Rulík et al., 2013).

Obr. 11.2. Schéma kombinací přístupů ke studiu mikrobiálních společenstev (Sharma & Rai, 2011).

Abychom získali relevantní odpovědi na otázky spojené s biogeografií protist, je potřeba kombinovat také metodické přístupy od (1) metod terénního výzkumu, (2) laboratorních – především kultivačních – metod a (3) moderních molekulárně-biologických metod (Obr. 11.2.). V mnohých případech jsou pak biogeografické studie poměrně časově náročné a zapojením metod molekulární biologie se stávají také finančně nákladnými.

Biodiverzita protistních organismů je velmi bohatá a také velmi heterogenní, protista jsou součástí prakticky všech biotopů, kde hrají role na různých ekologických a trofických pozicích. Studium biogeografie protist se nemusí nutně pojit s jejich globálním rozšířením, vzhledem k nedostatku poznatků o rozšíření (případně taxonomii nebo ekologie) mnoha protistních organismů mohou přinášet zajímavé výsledky i studie prováděné na lokální či regionální škále, jejich syntéza pak může dát informaci na škále globální.

Ve srovnání s makroskopickými organismy mají protista jednu zásadní nevýhodu, tou jsou jejich mikroskopické rozměry, výrazně nerovnoměrné rozmístění v biotopech, ať už v prostorové nebo časové škále. Při jejich studiu je proto vhodné vybrat, vzhledem ke kladeným výzkumným otázkám, vhodný metodický přístup. Je důležité brát v potaz, že reálný obraz o diverzitě poskytne jako komplexní průzkum. Krom studia diverzity společenstva v reálném čase, tedy ve vzorcích odebraných v rámci jednoho odběru s využitím klasických metod světelné nebo elektronové mikroskopie nutné pro specifické protistní skupiny, je nutné mít neustále na zřeteli, že některé druhy mohou být na lokalitě přítomny v podobě klidových stádií a nebo jsou zastoupeny velmi řídce. Je možné při mikroskopické analýze ty organismy přehlédnout, proto je v některých případech nutné doplnit získaná data o aktuální přítomnosti protistních organismů v rámci studované lokality o další informace na základě jejich kultivace. Tento přístup může přinést další cenné informace o druhovém složení protistních organismů, avšak má také své limity. Některé protistní organismy jsou velmi obtížně kultivovatelné, pro některé nejsou v současné době vyvinuty použitelné kultivační metody apod. (Obr. 11.3.). Proto se v poslední době během studií mikrobiálních společenstev přechází ke kombinaci terénních metod a metod molekulární biologie, především environmentálnímu sekvenování a metodám DNA barcodingu (viz dále).

Obr. 11.3. Rozlišení mikroorganismů podle jejich kultivovatelnosti (Rulík et al., 2015).

Při studiu protistních společenstev na lokální/regionální škále, lze postupovat tradičními metodami ekologického průzkumu, tedy kombinací informací o druhovém složení s environmentálními daty. Jak už bylo zmíněno, je nutné plánovat studie a experimenty tak, aby pokrývaly jak prostorovou škálu (odběry na gradientu, odběry společenstev z rozdílných habitatů, mikrohabity apod.), tak škálu časovou, kdy důležitou roli hraje především sezónní dynamika různých protistních skupin, přítomnost klidových stádií apod. S těmito přístupy lze studovat například rozšíření některých protist v rámci sledované oblasti, zaměřit se na otázky ostrovní biogeografie či studia vektorů. Samozřejmě i pro studium na lokální či regionální škále, lze aplikovat moderní metody molekulární biologie.

Pokud se chceme zabývat studiem biogeografie protistních organismů na globální škále, nabízí se již především využití metod molekulární biologie, kdy jsou realizovány klasické fylogenetické či fylogeografické studie, často zaměřené na úzkou taxonomickou jednotku (nejčastěji na úrovni distribuce rodu či čeledi) a v poslední době jsou mnohem častěji využívány metody environmentálního sekvenování, DNA barcodingu apod. V dřívějších dobách byly ke studiu mikrobiálních společenstev využívány také některé tzv. fingeprintingové metody, které však byly postupně vytlačeny moderními metodami.

Fylogenetické studie se zaměřením na biogeografii představují především fylogenetickou analýzu zájmového taxonu, nejčastěji rodu, na základě materiálu získaného z lokalit napříč globálním rozšířením tohoto organismu, často jsou využívány kultury studovaných organismů uchovávaných ve sbírkách kultur s vlastními izoláty. Dříve byly tyto studie často limitovány nutností získat kulturu studovaného organismu, v dnešní době je možné využít metody izolace jednotlivých individuí pro potřebu jejich osekvenování, odpadá tedy limitace nutností kultivace. Fylogenetické studie se opírají o fylogenetické stromy, při jejichž konstrukci se využívá sekvencí získaných buď z veřejných databází či z vlastních studií. Studie mohou být postavené na jednom či více genech a z výsledného fylogenetického stromu lze vyčíst informace o evolučních vztazích organismů. Ke konstrukci fylogenetických stromů se využívá mnoho metod (Rulík et al., 2015). Příkladem geografické studie protistních organismů s využitím fylogenetických metod je práce Bass et al. (2007), kteří studovali diverzitu tří skupin cerkomonád, skupiny drobných, velmi rozšířených bičíkovců, s cílem zjistit jejich globální distribuční vzorce. Vzorky odebraly z různých oblastí (Obr. 11.4.) a provedli fylogenetickou analýzu některých genů v rámci tří skupin cerkomonádních protist. Jejich výsledky pak ukázaly, že podobně jako makroorganismy, tato protista vykazují globální distribuční vzorce, některé z nich mají omezenou distribuci, jiné jsou široce rozšířené. Další příklady fylogenetických studií ve spojení s biogeografickou distribucí jsou uvedeny v rámci kapitol věnujících se jednotlivým skupinám protistních organismů (viz Kapitoly 8. – 10.).

Obr. 11.4. Místa odběrů vzorků a výsledné fylogenetické stromy v rámci studie (Bass et al., 2007). Geografické distribuční vzorce ve stromech vyznačeny barevně.

Obr. 11.5. Rozšíření dvou hlavních haplotypů mitochondriální DNA u Fucus vesiculosus (Macaya et al., 2016).

Poměrně mladou metodou fylogenetických analýz je studium fylogeografie, jejímž cílem je popisovat principy, vzory a procesy, které přispěly ke geografickému rozšíření jednotlivých linií organismů, především v kontextu jejich evoluce a ekologie (Hu et al., 2016). Příkladem takové studie může být práce Coyer et al. (2011), kteří studovali distribuci druhu Fucus vesiculosus v severním Atlantiku. Jejich výsledky ukazují, že šíření (expanze) druhu Fucus vesiculosus začalo během doby meziledové (před 300 000–200 000 lety) a že v průběhu poslední doby meziledové (před 30 000–20 000 lety) došlo ke kolonizaci z glaciálního refugia v jihozápadním Irsku směrem do Skandinávie, centrálním Atlantských ostrovů a západního Pacifiku (Obr. 11.5.). Další příkladové studie jsou uvedené v kapitole věnované mořským makroskopickým řasám (viz Kapitola 9.).

Dříve se při studiu mikrobiálních společenstev využívaly také tzv. metody fingerprintingu, což jsou metody, které vedou ke stanovení profilu diverzity mikrobiálního společenstva s využitím technik molekulární biologie a jsou založeny na odhadu množství variant genu ve společenstvu, kdy se předpokládá, že každá odlišná varianta genu představuje odlišný typ organismů. Tyto metody dávaly celkový pohled na společenstvo, avšak neříkaly nic o přímé identifikaci nebo počtech buněk jednotlivých organismů. Princip těchto metod tedy spočíval v extrakci celkové DNA z environmentálního vzorku, PCR reakce s cílem zachytit určitý gen nebo oblast DNA a vyhodnocení s využitím elektroforézy. Využití těchto metod se nabízelo ke studování biodiverzity, změny ve společenstvech, vlivu faktorů apod., mohly být využity i při studiu sukcese společenstva, vlivu různých typů disturbancí či vlivu polutantů. Jejich hlavní výhodou byla relativní rychlost a nízká cena, možnost zpracovat velké množství materiálu a absence potřeby sekvenčních dat. Velkou nevýhodou těchto metod byla jejich kvalitativnost, nikoliv kvantitativnost a pracování s neručenými taxony, kdy šlo v případě některých technik dále využít sekvenování k získání informace o taxonomické pozici zájmového organismu. Dnes jsou tyto metody ve velkém množství případů nahrazeny moderními metodami environmentálního sekvenování.

Obr. 11.6. Schématické znázornění denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Zdroj: Wikipedia.

Příkladem metody fingerprintingu je elektroforéza v gradientovém denaturačním gelu (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE), kdy je získaný PCR produkt vizualizován elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s postupně se zvyšujícím gradientem koncentrace denaturujících látek (v případě DGGE foramidu a močoviny). Z výsledného gelu lze pak porovnávat podobnost studovaných společenstev (Obr. 11.6.).

V posledních letech se do popředí studia společenstev dostávají metody sekvenování nové generace (next generation sequencing, NGS), což jsou metody, které umožňují rychlé a relativně levné získání velkého množství osekvenovaných vzorků najednou. V současné době se používá celá řada různých technologií sekvenování nové generace, kdy jsme schopni během jedné sekvenační reakce přečíst až stovky miliónů bází, toto obrovské množství je samozřejmě nutné pro další studie utřídit a zpracovat. Princip těchto metod je v ukotvení milionů sekvenačních reakcí na čip a simultánní detekce každé jednotlivé reakce pomocí velmi citlivých metod s obrovským rozlišením, využívanými technologiemi jsou například pyrosekvenace (metoda 454/Roche), Illumina (Solexa) Genome Analyzer nové metody (např. The MinION, Oxford Nanopore Technologies). Těchto technik lze pak využít při environmentálním sekvenování. Montiel-González et al. (2017) využili pyrosekvenování úseku 16S rRNA pro studium a porovnání diverzity ve dvou půdních společenstvech, výsledky těchto studií jsou pak nejčastěji prezentovány grafy, kde jsou procentuálně zastoupené skupiny reprezentované získanými OTUs (Obr. 11.7.).

Obr. 11.7. Porovnání mikrobiálních půdních společenstev na základě dat z pyrosekvenování (Montiel-González et al., 2017).

Poslední moderní metodou je DNA barcoding (Obr. 11.8.), což je metoda vyvinutá za účelem identifikace druhů pomocí krátkých specifických úseků DNA, které by se měly co nejvíce lišit mezi jednotlivými druhy a zároveň by se měly v rámci stejného druhu co nejvíce podobat, jedná se o jakousi molekulární paralelu čárových kódů (barcodes), které slouží například k přesné a jednoznačné identifikaci zboží v prodejnách. V současné době se pozornost zaměřuje především ke tvoření specifických barcodů pro jednotlivé skupiny organismů, cílem by však mělo být vytvoření databáze barcodů pro všechny živé organismy a nejlépe objevení jednoho univerzálního barcodu, který by sloužil k určení jak existujících tak dosud nepopsaných organismů.

DNA barcoding se již uplatnil v mnoha studiích zaměřených na protistní organismy, např. k potvrzení platnosti dosavadního větvení šesti větví ve dvou hlavních skupinách rodu Symbiodinium, k odhalení dvou linií u obrněnky Oxyrrhis marina, představujících pravděpodobně dva oddělené druhy, ke studiu druhového komplexu nálevníka Paramecium aurelia, kde se s využitím DNA barcodingu ukázaly vysoké vnitrodruhové odchylky značící existenci více druhů apod.

Využití DNA barcodingu může být využito při studiu biodiverzity a biogeografie mořských organismů, Vernetter et al. (2020) představili projekt Ocean Barcode Atlas (http://oba.mio.osupytheas.fr/ocean-atlas/), webovou službu určenou pro biology, kteří chtějí prozkoumat biodiverzitu a biogeografii mořských organismů. Jedná se o dynamickou aplikaci umožňující vytváření interaktivních map s ekologickým kontextem (teplota, kyslík, zeměpisná šířka), využívá několika barcodových knihoven (Tara Oceans eukaryotic 18S-V9 rDNA, Tara Oceans 16S / 18S rRNA miTags a metabarcody 16S-V4V5 shromážděné během expedice Malaspina-2010), příklad výstupu z atlasu je na Obr. 11.9.

Obr. 11.8. Schéma aplikace metody DNA barcodingu (Valentini et al., 2009).

Obr. 11.9. Biogeografie skupiny Symbiodiniaceae (A) a jejich relativní abundance (B) na otevřeném oceánu podél zeměpisné šířky, vše vztažené k velikostním frakcím planktonu (Vernetter et al., 2020).

Pravděpodobně největší globální výzkumnou výpravou za účelem získat informace k pochopení komplexity oceánických ekosystémů a pochopení, jaké biotické a abiotické procesy určují vlastnosti těchto ekosystémů, je projekt Tara Oceans (https://oceans.taraexpeditions.org/). Je to robustní vědecká výprava, jejímž cílem bylo získání informací o rozmanitosti planktonu, jeho interakcí, funkcí, fenotypové variability na globálních taxonomických a prostorových škálách a tyto informace mimo jiné přednést veřejnosti a státním institucím. Vědecká expedice byla realizována na 36 metrů dlouhém škuneru s hliníkovým trupem, který byl postaven v roce 1989 a sloužil například k expedicím do Antarktidy (1991-1996). Tato loď byla později zakoupena a věnována pro vědecké účely, byla upravena za účelem expedice Tara Oceans, a to tak, aby poskytovala jak zázemí pro posádku, tak vybavení pro odběr, zpracování a analýzu získaných vzorků (Obr. 11.10.).

Obr. 11.10 Loď expedice Tara Oceans a detail na vybavení z paluby lodi (Sunagawa et al., 2020).

V letech 2009–2013, kdy se uskutečnila expedice, bylo během 140 000 km dlouhé plavby odebráno více než 35 000 vzorků planktonu z 210 odběrových míst napříč světovým oceánem (Obr. 11.11). Zpracováním vzorků bylo získáno více než 60 terabází sekvenačních dat, více než 7 000 000 snímků apod.

Obr. 11.11. Mapa expedice Tara Oceans s vyznačenými odběrnými místy (Sunagawa et al., 2020).

Obr. 11.12. Metodické pozadí projektu Tara Oceans, detaily v textu (Sunagawa et al., 2020).

Na každém z odběrových míst byly systematicky odebírány vzorky a měřeny základní parametry prostřední s využitím speciálních odběrových zařízení či měřících sond. Během jednotlivých odběrů byly odebírány vzorky během dne a během noci s využitím pěti typů planktonních sítí (Obr. 11.12.-Aa) a velkoobjemové peristaltické pumpy (Obr. 11.12.-Ab) spolu s odběry vzorků vody do Niskinových lahví (Obr. 11.12-Ac) od povrchové vrstvy do hloubek 1000 m. Z parametrů bylo stanovováno zastoupení pigmentů, živiny, rozpuštěný organický uhlík, množství kyslíku, chlorofyl, fotosynteticky aktivní záření (PAR) apod. V rámci odběrů bylo cílem odebrat co nejvíce z 12 frakcí planktonu, od picoplanktonu po megaplankton (Obr. 11.12.-B), byly získávány různé datasety genomických dat pro pozdější zhodnocení diverzity a relativního zastoupení jednotlivých skupin, bylo také využito metod DNA barcodingu (Obr. 11.12.-C), všechno bylo doprovázeno obrazovou dokumentací (Obr. 11-12.-D) (Sunagawa et al., 2020).

Výsledky přispívají ke globálnímu pochopení diverzity a fungování oceánických ekosystémů, poskytují informace o distribuci oceánických organismů jak na v rámci světového oceánu, tak v jeho různých hloubkách apod. Souhrn zajímavých výsledků z tohoto projektu shrnuje například Pierella Karlusich et al. (2020) nebo Sunagawa et al., (2020), příkladem výstupů z projektu je například relativní abundance fotosyntetizujících skupin napříč zeměpisnými šířkami (Obr. 11.13.).

Obr. 11.13. Abundnace fotosyntetických zástupců planktonu v závislosti na zeměpisné šířce (Pierella Karlusich et al., 2020).

Další výsledky pak přímo ukazují biogeografické distribuční vzorce některých protistních skupin na základě dat z expedice (Obr. 11.14.).

Obr. 11.14. Distribuce protistních skupin napříč světovým oceánem, velikost kolečka reflektuje míru zastoupení a barevná škála Shannonův index biodiverzity (Pierella Karlusich et al., 2020).