ALGOLOGICKÉ KULTIVAČNÍ TECHNIKY
Fyziologické aspekty kultivace sinic a řas
Fyziologické aspekty spojené se sinicemi a řasami zahrnují jejich nároky na živiny (viz Kapitola 3.1.), dostupnost živin v kultivačním médiu a případnou limitaci a vlastní růst kultur. V závěru této kapitoly jsou také uvedeny příklady možného využití kultur sinic a řas v ekofyziologických experimentech.
Limitace živinami
Z makroprvků jsou nejčastěji limitující dusík, fosfor a uhlík. Limitace může být způsobena jak nedostatkem některého z těchto prvků, tak i jeho přebytkem. Pokud vyneseme růstovou rychlost jako funkci koncentrace živin, získáme 4 zóny (Grobbelaar, 2013):
zónu s výrazným nedostatkem živin (deficient zone, “zóna strádání”), ve které nastává dramatický růst buněk po přidání živin;
zónu, ve které je koncentrace živin taková, že jejich přídavek nemá zásadní vliv na růst (transition zone, “zóna optimálního růstu”);
zónu, ve které přidání živin nemá žádný efekt na růst (adequate zone, “zóna saturace”), tato zóna je široká pro makroprvky, ale úzká pro mikroprvky;
zónu, ve které má přídavek živin negativní vliv na růst (toxic zone, “toxická zóna”).
Stejně jako je důležitá koncentrace živin, je důležitý jejich poměr, atomární poměr uvedených makroprvků je v rostlinné biomase v poměrů 106C : 16N : 1P, příklad možné limitace způsobené poměry dusíku a fosforu pro hypotetickou řasu ukazuje Obr. 10.1. Z tohoto hypotetického modelu lze obecně usuzovat, že poměr N:P neodpovídající výše uvedenému poměru v rostlinné biomase povede k limitaci jedním nebo druhým prvkem, např. v médiu BG-11 je poměr N:P 45:1, v tomto médiu tedy můžeme předpokládat limitaci fosforem, v médiu BBM je poměr N:P 4:1, tudíž můžeme předpokládat limitaci dusíkem.
Obr. 10.1. Specifická růstová rychlost v závislosti na poměru N:P pro hypotetickou řasu s růstovou rychlostí μmax = 1, (Grobbelaar, 2013).
Růst kultury
Během svého růstu procházejí kultury několika fázemi, během kterých se zásadně mění růstová rychlost buněk v kultuře a současně dochází ke změnám ve složení média (vyčerpání zdrojů) a k následnému útlumu růstu, který může vést až k úplnému odumření kultury. Růstovou křivku spolu se změnami růstové rychlosti ukazuje Obr. 10.2., srovnání jednotlivých růstových fází ukazuje tabulka 10.1.
V počáteční fázi – lag fázi – se čerstvě přeočkované inokulum aklimatizuje v nových podmínkách čerstvého média. Během vyrovnávání se s novými podmínkami může být inokulum náchylné na různé stresové faktory (vysoká/nízká teplota, intenzivní/nedostatečné osvětlení, složení média apod.), které ovlivňují délku lag fáze a současně mohou v extrémních případech způsobit odumření inokula. Délka lag fáze je specifická pro různé skupiny sinic a současně se také odvíjí od kvality inokula.
Po počáteční aklimatizaci začíná růst buněk inokula (tzv. akcelerační fáze), ve které buňky dosahují nejvyšší růstové rychlosti. Tato fáze je následována exponenciální fází růstu, ve které buňky víceméně kontinuálně rostou, dokud nezačnou být limitovány některým faktorem (živiny, světlo…). Růstová rychlost je ovlivněna druhově a současně vlastnostmi kultivačního prostředí (intenzita světla, teplota, živiny apod.). Exponenciální fáze je poměrně krátká, jelikož si buňky začnou postupně stínit a jejich růst se začne zpomalovat. Během exponenciální fáze je nejvhodnější období pro přenesení inokula do čerstvého média.
Při limitaci přecházejí buňky do zpomalovací fáze, kdy pomalu přestávají růst a přecházejí do fáze stacionární, kde je již růstová rychlost nulová a buňky pomalu vyčerpávají naakumulované zásoby, počet buněk se již nemění a růstová rychlost je nulová. Po vyčerpání následuje fáze odumírání, kdy počty buněk začnou klesat a růstová rychlost je negativní, důvodem poklesu není pouze limitace výše uvedenými faktory, ale také zvýšená koncentrace odpadních metabolitů.
Tab. 10.1. Přehled jednotlivých fází růstu kultury.
Obr. 10.2. Růst kultury (nahoře) a změny v růstové rychlosti (dole) (Barsanti & Gualtieri, 2014, upraveno).
Měření růstu kultury
Růst kultury lze sledovat různými způsoby nebo charakterizovat různými metodami, od nejjednodušší orientační vizuální kontroly, přes běžné laboratorní metody až po moderní přístrojové metody nebo metody pracující s analýzou obrazu.
Pro rychlé rutinní laboratorní sledování růstu kultur pomocí počítání buněk v počítacích komůrkách (counting chambers, Obr. 10.3.) se využívá speciálních sklíček s vybroušeným rastrem (mřížkou), existují různé typy těchto komůrek, např. Cyrus, Bürker, Thom, Nageotte, Neubauer apod. V laboratorní a mikrobiologické praxi je nejpoužívanější komůrkou typ Bürker, v hydrobiologii pak typ Cyrus. Společný princip komůrek je v nanesení vzorku do komůrky a počítání buněk v jednotlivých ploškách mřížky, následně je pak možné spočítat množství buněk přítomných v kultuře se započítáním příslušného zředění původní kultury.
Obr. 10.3. Počítací komůrka (Tortora et al., 2013, upraveno)
U velkoobjemových kultur se k charakterizování míry stanovení růstu využívá porovnání přírůstku biomasy, a to nejčastěji v podobě sušiny (např. g.l-1), případně měřením celkového organického uhlíku (total organic carbon, TOC), nejčastěji titrační metodou – rozpuštění řasového peletu z 1 ml suspenze v reakčním roztoku (HgSO4, H2SO4, Ag2SO4, K2Cr2O7), titrace proti 0,1 N Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O a následné stanovení TOC z kalibrační křivky.
Ke stanovení růstu kultury lze použít spektrofotometrické stanovení obsahu chlorofylu. Princip spektrofotometrie je založen na měření koncentrace látky v roztoku na základě pohlcování světla různých vlnových délek. Spektrofotometrie je založena na Lambert-Beerově zákoně, který popisuje vztah mezi koncentrací látky v roztoku a její absorbancí: Aλ=Eλ^ ⋅l⋅c(M) (*17). Chlorofyl je ze suspenze extrahován (nejčastěji se používají organická rozpouštědla jako aceton, methanol, směsi methanolu a ethanolu, diethylether apod.) a jeho koncentrace je následně změřena na spektrofotometru proti slepému vzorku (blanku), který představuje extrakční činidlo. Koncentrace chlorofylu se nejčastěji měří v oblasti absorpčních maxim chlorofylu.
Obr. 10.4. Princip měření optické hustoty buněk (turbidity)
K optickému měření hustoty buněk v kultuře lze také využít principů turbidimetrie, která vychází z toho, že kromě absorbance může při průchodu světla koloidním vzorkem docházet také k jeho rozptýlení, měření turbidimetrie lze realizovat s běžným laboratorním vybavením (spektofotometrem) a úbytek světla rozptylem při průchodu vzorkem lze popsat vztahem podobným Lambert-Beerovu zákonu (Obr. 10.4.). Množství rozptýleného světla závisí na koncentraci částic, jejich velikosti a také vlnové délce světla, v praxi se nejčastěji využívá světla o vlnových délkách 340 - 450 nm. Při turbidimetrických měřeních je často problém vytvořit dostatečně stabilní suspenzi, která by byla stálá po celou dobu měření, proto se do vzorků přidávají ochranné koloidy (např. polyethylenglykol).
Z moderních metod lze využít průtokovou cytometrii (Kapitola 5.2.) nebo různých počítačových metod pro analýzu obrazu (např. s využitím volně stažitelného programu ImageJ (*18)). Nedestruktivní metodu pro analýzu relativní růstové rychlosti kultur na Petriho miskách založené na analýze obrazu vytvořil Hauer & Liška (2007) – kultura na misce je spolu se standardem (šedý obdélník, 50% šedi) vyfocena v laminárním boxu standardním fotoaparátem a následně je v programu vyhodnocena, opakováním a porovnáním lze určit relativní růstovou rychlost.
Obr. 10.5. Příklad kultury na misce určené pro analýzu s programem NAJA Image Analysis, vlevo dole standard 50% šedi (Hauer & Liška, 2007).
Využití kultur v ekofyziologických pokusech – příkladové studie
Kultury sinic a řas hraje zásadní roli při poznání jejich biologie – možnosti ultrastrukturálních, morfologických, molekulárních a biochemických a jiných studií. Pro některé skupiny je zásadní možnost studia životního cyklu a jiných fyziologických procesů. Kultury sinic a řas lze využít také v různých ekofyziologických experimentech. Různých designů ekofyziologických experimentů je poměrně velké množství, v následujícím textu jsou uvedeny jen některé ilustrační příklady.
Sinic a řas lze využívat při ekotoxikologických testech, například testy akutní toxicity, ve kterých se nejčastěji využívají zelené řasy, princip testu spočívá ve stanovení toxického účinku vodou vyluhovatelné látky na inhibici růstu a rozmnožování zelené řasy v jednotlivých koncentracích sledované látky ve srovnání s kontrolami v čistém živném roztoku. Jedná se o standardizované metodiky umožňující porovnání výsledků mezi laboratořemi, mezi nejrozšířenější patří metodiky ISO (*19) a OECD (*20) (Říhová Ambrožová, 2006). Kromě laboratorních experimentů studujících vliv různých látek, případně jejich potenciální toxicitu, na testované řasové organismy, lze tyto experimenty provádět také v terénu, např. Bauer et al. (2012) sledovali vliv na kultury krásnoočka Lepocinclis acus umístěné v polopropustných membránách na dvě místa na toku v Argentině, aby sledovali vliv průmyslových odpadů na životní prostředí, výsledky ukazují morfologické změny u kultur exponovaných na vybraných místech (viz. Obr. 10.6).
Obr. 10.6. Sledování vlivu průmyslu na životní prostředí s využitím kultury řas (Bauer et al., 2012). Mapa s vyznačenými místy, kde byly exponovány kultury (vlevo), morfologické změny u kultury z jednotlivých míst a srovnání s laboratorní kontrolou (vpravo).
Pro ekofyziologické studie se osvědčilo využívání tzv. zkřížených gradientů (crossed gradients, Obr. 10.7.), zařízení vytvářející gradient dvou parametrů, nejčastěji ozářenosti a teploty, na tomto zařízení jsou pak následně kultivovány sinice nebo řasy (v Erlenmeyerových baňkách, na Petriho miskách nebo sérologických destičkách...). Ke kombinaci se zkříženými gradienty světla a teploty je možné přidat ještě třetí faktor, nejčastěji gradient koncentrace živin. Tato metoda nabízí široké spektrum možných studií, nejčastěji ve spojení s růstovým optimem, produkcí sekundárních metabolitů nebo morfologickou variabilitou.
Zkřížených gradientů lze využít při zjišťování růstových podmínek a růstového optima, např. Hindák et al. (2013) studoval 10 kmenů sinic vyizolovaných z různých termálních pramenů z různých částí světa na poměrně širokém gradientu světla a teploty (7–80 W.m−2, 12–40 °C). Výsledky ukázaly, že nejvíce tolerantním druhem je Synechococcus bigranulatus (Obr. 10.8.) pocházející z termálního pramene v Rupite (Bulharsko).
Obr. 10.7. Příklad zařízení pro experimenty s využitím zkříženého gradientu teploty a světla (Siver, 1983).
Při studiu morfologické variability (plasticity), lze také využít zkříženého gradientu světla a teploty, jak ukazuje práce Němcové et al. (2010), ve které byla studována morfologická plasticita křemičitých šupin u zlativky Synura echinulata. Výsledky ukazují, že šupiny vykazují prostředím ovlivněnou morfologickou plasticitu (Obr. 10.9.), avšak důležité determinační znaky zůstaly nezměněny. Nižší teploty spolu s dlouhodobým působením vede ke zmenšování šupin a k jejich morfologické plasticitě, to autoři vysvětlují jako výsledek působení environmentálního stresu.
Obr. 10.8. Příklad gradientu teploty (a) a ozářenosti (b), výsledek růstu sinice Synechococcus bigranulatus (c) uvedený v sušině (g.l-1) (Hindák et al., 2013, upraveno).
Obr. 10.9. Příklady průměrných tvarů šupin doplněné o teoretický model v závislosti na teplotě a světle (Němcová et al., 2010).
Zkřížených gradientů lze využít také při studiu produkce různých látek, například Kumar et al. (2017) studovali produkci extracelulárních (EPS) a intracelulárních polysacharidů (IPS) zelenou řasou Dictyosphaerium chlorelloides v závislosti na teplotě a osvětlení. Výsledky ukázaly, že největší produkce intracelulárních polysacharidů byla při teplotách kolem 19,2 °C a ozáření 50,3 μmol.m2.s-1, extracelulární polysacharidy byly nejvíce produkovány při 25,7 °C a podobné ozářenosti jako v případě IPS, čehož by se dalo využít pro produkci kontrolovanou teplotou.