ALGOLOGICKÉ KULTIVAČNÍ TECHNIKY
Tradiční metody izolace mikrořas
Izolace na agarových plotnách
Využití agarových ploten poskytuje široké spektrum metod vhodných jak pro izolaci sinic a řas z přírodních vzorků nebo obohacených kultur, tak pro purifikaci již existujících kultur v případě kontaminací, především bakteriemi. Detailněji se některým z metod věnují návody na cvičení (viz Kapitola 14.1).
Obecným principem metod s využíváním agaru je “zředění” vzorku pasážováním na povrchu agaru, sprejováním suspenze na povrch agarových ploten nebo protažením vzorku agarem. Mnohé z těchto metod se také mohou používat při purifikaci kontaminovaných kmenů. Základním předpokladem je schopnost zájmové sinice nebo řasy růst na agaru, což většinou není problém u půdních řas a sinic nebo u většiny zelených kokálních řas, ale i někteří bičíkovci (např. zástupci rodu Chlamydomonas) jsou schopni růst na agarem zpevněných médiích.
Při práci s přírodními vzorky je poměrně velké riziko kontaminace bakteriemi a vláknitými houbami, které jsou ve vzorcích přítomny. Mnohdy je proto postupy nutné opakovat a používat agarové plotny s vhodnými antibiotiky a antimykotiky.
Základní jednoduchá metoda, tzv. pasážování, je založená na opakovaném roztírání vzorku po agarové plotně několika tahy očkovací kličkou, která je mezi jednotlivými kroky (na Obr. 4.3. označení číslicemi) opalována. Tímto způsobem se postupně zřeďuje biomasa individuí obsažených v hrubé kultuře nebo v přírodním vzorku, u výsledných kolonií se pak dá předpokládat, že jsou potomstvem jednoho individua. Takto narostlé kolonie je pak možné buď přesadit do zkumavky nebo jamkové destičky s tekutým médiem nebo znovu rozetřít na agarovou plotnu, případně je možné pasážování zopakovat.
Obr. 4.3. Schéma roztěrů biomasy na agarové plotně (Benson, 2002)
Agarových ploten lze také využít k izolaci půdních a subaerických sinic a řas způsobem, kdy je na agarovou plotnu rovnoměrně nasypána půda nebo seškrab ze substrátu a tyto misky jsou kultivovány při optimálních podmínkách. Sinice a řasy, které jsou ve vzorcích přítomné, se postupně rozrůstají kolem substrátu a vzniklé kolonie je možné přepíchnout na novou misku a získat tak čistou kulturu, která však s největší pravděpodobností nebude klonální, ale jednodruhová. Pro získání čistých klonálních kultur je možné provést reizolaci některou z uvedených metod. Detailněji se této metodě věnuje Kapitola 14.5.
Metoda, která využívá rozptylu suspenze – sprejovací metoda – obsahující zájmové organismy, může představovat poměrně efektivní způsob, jak získat čisté klonální kultury. Buňky jsou ze suspenze rozstřikovány pomocí proudu sterilního vzduchu na agarovou plotnu, která je následně kultivována za optimálních podmínek. Použití této metody vyžaduje optimalizaci, aby byla suspenze buněk nanesena na misky v dostatečném zředění tak, aby se narostlé kolonie nepřekrývaly, ideální je připravit si vzorek v různém zředění. Narostlé kolonie je možné přenést do zkumavek nebo jamek s tekutým médiem, případně rozetřít na agaru. Suspenze může být rozprašována jednoduchou aparaturou (Obr. 4.4.) anebo může být kapána z pipety přímo do proudu sterilního vzduchu proti misce s agarem.
Obr. 4.4. Schéma uspořádání pomůcek pro sprejovací metodu (Surek & Melkonian, 2004). A – proud sterilního vzduchu, C – kapilára, P – Petriho miska s agarem, S - suspenze buněk, T – zkumavka.
Pro některé sinice a řasy, které nejsou schopné růst na povrchu agaru se využívá metoda agarových ploten s nižší koncentrací agaru, jedná o modifikaci Beijerinckovy metody, který však používal želatinu. Touto metodou lze například izolovat pikoplanktonní sinice. Obohacená kultura nebo přírodní vzorek se smíchá s tekutým agarem, který však musí být poměrně chladný (ideálně ve své gelující fázi), aby teplota nepoškodila organismy. Po smíchání se směs nalije na misky a nechá se ztuhnout, takovéto misky se pak kultivují za optimálních světelných a teplotních podmínek. Vyrostlé kolonie, uzavřené v agarové hmotě, jsou pak pomocí mikropipety vypíchnuty a přeneseny do zředěného kultivačního média. Klasický agar je v této metodě možné nahradit agarem s nižším bodem tání, který eliminuje riziko teplotního poškození buněk.
Agarových ploten s nižší koncentrací může být také využito při izolaci vláknitých řas, kdy jsou tyto řasy sterilně protahovány řídkým agarem s cílem odstranit z nich epifytická společenstva jiných sinic a řas. Přečištěná vlákna jsou pak následně kultivována na klasických agarových nebo v tekutých médiích. Tato metoda je vhodná především pro spájivky, v případě řas, které jsou výrazněji porostlé epifyty (např. Vaucheria nebo Cladophora) je vhodné nejdříve vlákna zbavit většiny epifytů pomocí ultrazvuku.