ALGOLOGICKÉ KULTIVAČNÍ TECHNIKY

Sterilní (aseptickou) práci představuje soubor základních pravidel a dovedností, které jsou nepostradatelné pro prakticky všechny činnosti spojené s kultivací sinic a řas a mikroorganismů obecně. Správně a rutinně zvládnuté dovednosti jsou zcela nezbytné pro získání, izolování a udržování kultur sinic a řas v co nejvyšší možné kvalitě – čistotě.

Metody sterilní (aseptické) práce jsou řetězcem základních kroků: (1) sterilizace materiálů a pomůcek, (2) dezinfekce prostředí, (3) aseptická práce v laminárních boxech a (4) likvidace odpadu.

Sterilizace představuje soubor metod nebo činností, které mají za cíl odstranění nebo usmrcení nežádoucích buněk v daném prostředí – kultivační média, pomůcky apod. Ke sterilizaci lze využít fyzikálních nebo chemických metod (viz Kap. 2.1.). Ke sterilizaci pracovního prostředí – povrchy laminárních boxů, kultivačních místností – se využívá dezinfekčních metod.

Dezinfekcí rozumíme zničení mikroorganismů pomocí vybraných metod. V laboratorních podmínkách se jedná nejčastěji o dezinfekci fyzikální (nejčastěji využití germicidních UV-C zářivek) nebo chemickou (využití různých chemikálií nebo komerčně dostupných prostředků). Velkým problémem spojeným s dezinfekcí je potenciální možnost vzniku rezistence, nejčastěji v případě bakterií nebo mikroskopických hub, která je často způsobená dlouhodobým využíváním jednoho typu dezinfekčního prostředku. Riziko vzniku rezistence lze předejít kombinací několika různých dezinfekčních prostředků, případně využitím v kombinaci s germicidními zářivkami.

Pro snížení rizika kontaminace kultur při manipulaci s nimi je v podstatě nezbytné pracovat v laminárních boxech (tzv. flow boxech, viz Kap. 2.2.), které díky speciální úpravě filtrů zaručují maximální možnou sterilitu pracovního prostředí. V některých, převážně mikrobiologických laboratořích, se pracuje v místnostech, které jsou sterilizovány s použitím germicidních zářivek, případně v UV-C zářením sterilizovaných boxech (podobných těm, které se využívají v molekulární biologii při PCR) – toto prostřední se dá využít při iniciální izolaci kultur, pro jejich dlouhodobé udržování není vhodné. Podobně tak není zcela dostačující manipulace s kulturami v blízkosti zapáleného plynového kahanu, kde se předpokládá, že případné kontaminace z okolí kultury budou „strhávány“ proudem horkého vzduchu. Při práci v laminárních boxech, ale také u dalších uvedených alternativních postupů, je také zásadní dodržovat pravidla pro aseptickou práci při přípravě kultivačních médií, pomůcek a při vlastní práci s kulturami – tyto rutinní metody jsou detailně rozebrané v rámci návodů pro praktická cvičení (viz Kap. 14.1 a 14.2.)

Při práci s kulturami sinic nebo řas se často pracuje s organismy, které pocházejí z jiných území a které představují potenciální nebezpečí biologických invazí. Z tohoto důvodu je zásadní dodržovat také některá pravidla při  likvidaci odpadů. Tato pravidla neplatí pouze pro materiál získaný v zahraničí, měla by být obecně dodržována i pro izoláty, které pocházejí z našeho státu. Do laboratorních výlevek, případně od směsného komunálního odpadu, nikdy nesmějí přijít živé organismy. Nejúčinnějším způsobem je sterilizace odpadu autoklávováním, za tímto účelem je vhodné mít speciální autokláv určený právě pro likvidaci odpadů. Pokud není možné odpad inaktivovat prostřednictvím autoklávování, je ve většině případů dostačující chemická sterilizace v roztoku chlornanu sodného (komerčně dodávaný jako SAVO®, které obsahuje přibližně 4,7 % chlornanu sodného), případně ve 2 % - 4 % roztoku kyseliny peroxooctové (komerčně dodávané jako Persteril® 36, což je stabilizovaná směs 36 % kyseliny peroxooctové a peroxidu vodíku, kyseliny octové a vody). Podobně by měly být dekontaminovány i použité plastové špičky, skleněné kapiláry a jiný materiál, který přichází do kontaktu s živými kulturami. V běžném laboratorním provozu lze k dekontaminaci využít i různě koncentrované roztoky ethanolu, případně komerčně vyráběné dezinfekční prostředky (viz výše).

Metody sterilizace

Ke sterilizaci pracovních pomůcek a kultivačních médií, ale také pracovních ploch se používají různé fyzikální metody (sterilizace teplem, filtrace, elektromagnetické vlny apod.) nebo metody chemické sterilizace. Výběr sterilizační metody se odvíjí od vlastností sterilizovaných materiálů a pomůcek.

Sterilizace teplem

Sterilizace teplem představuje nejčastěji využívanou metodu k sterilizaci nástrojů, pomůcek a kultivačních médií, zahrnuje prosté opalování pomůcek a hrdel kultivačních nádob, přes působení suchého či vlhkého tepla, teploty ve spojením s tlakem (autoklávování) a metody pasterizace a tyndalizace. 

K přímé sterilizaci plamenem se klasicky využívají lihové nebo plynové kahany, z nichž efektivnější je samozřejmě kahan plynový. Opalování se využívá především při práci v laminárních boxech. Tato práce vyžaduje cvik a její zvládnutí je zásadním předpokladem pro práci s libovolnými kulturami mikroorganismů (detailně v kapitolách k praktickým cvičením viz Kap. 14.1. a 14.2.). Hrdla kultivačních nádob a pomůcky se opalují na nad redukční zónou v nesvítivé části oxidační zóny plamene, kde je teplota nejvyšší, obvykle kolem 1500 °C (záleží na typu kahanu).

V dnešní době dochází k jisté automatizaci, kdy je možné pořídit speciální otočné držáky na očkovací kličky, které sterilizují kličky v pravidelných intervalech (Obr. 2.1.), případně sterilizátory využívající vysokých teplot (Obr. 2.2.), kdy dochází k zahřátí na teploty 900 až 1300 °C ve zlomku sekundy, lze jen však využít pouze na kovové pomůcky, takže při rutinní laboratorní práci s kulturami je nutné jej kombinovat s klasickými kahany. 

Dříve využívané metody tzv. přerušované sterilizace představují pasterizace (postup vyvinul v polovině 19. století Louis Pasteur) a tyndalizace (postup vytvořil v roce 1877 britský lékař John Tyndall), které se dnes již tak často nepoužívají a byly nahrazeny především filtračními metodami; pasterizace však hraje stále důležitou roli v potravinářském průmyslu. Tyto metody jsou vhodné pro sterilizaci termolabilních látek (např. vitamíny, antibiotika) nebo látek příliš viskózních pro filtraci. Princip obou metod je podobný a založený na zahřátí na vyšší teplotu, která poškodí přítomné mikroorganismy a zároveň nepoškodí sterilizovanou látku, a následné různě prudké ochlazení – viz Obr. 2.3. a 2.4. Tyndalizace má oproti pasterizaci výhodu, protože je do jisté míry účinnější proti sporulujícím mikroorganismům. 

Při tepelné sterilizaci pomůcek a kultivačních médií můžeme dále využít tří hlavních možností - (1) suchého tepla použitelného pro sterilizaci pomůcek, (2) vlhkého tepla a (3) působení teploty a tlaku při autoklávování. Při sterilizaci skleněných a kovových pomůcek je rutinní používání horkovzdušných sterilizátorů (laboratorních sušáren), ve kterých jsou potřebné pomůcky sterilizovány při vysokých teplotách (doporučuje se 250 °C po dobu 3 - 5 hodin nebo 150 °C po dobu 3 - 4 hodin). Pomůcky jsou zabaleny nejčastěji v hliníkové folii, případně jsou uložené ve speciálních toulcích. Tato metoda není vhodná pro plastové pomůcky a tekutá média. Při otevírání sušárny je vhodné vyčkat na pokles teploty pod 60 °C, kdy se sníží riziko kontaminace povrchu, případně špatně zabalených pomůcek, díky proudění horkého vzduchu ze sušárny. Klasická metoda, takzvané propařování, využívající vlhkého tepla sloužila dříve především k přípravě kultivačních médií, kdy ke sterilizaci dochází kontaktem s horkou vodní párou. K tomuto typu sterilizace se využíval tzv. Kochův hrnec, dnes se tato metoda používá především ke sterilizaci mořské vody a přípravě půdních extraktů a na půdě založených bifázických médií. 

V současné době je nejpoužívanějším způsobem rutinní sterilizace autoklávování, které je využíváno jak pro většinu pomůcek, tak pro téměř všechna kultivační média. Samotná sterilizace je zde realizována prostřednictvím vlhkého teplého vzduchu a zvýšeného tlaku, standardem je sterilizace při 121 °C a tlaku 101,3 kPa. V principu dochází během autoklávování k zahřívání vody do dosažení určité teploty a udržování této teploty po danou dobu. Délka doby sterilizace se odvíjí od objemu sterilizovaného roztoku (viz Tab. 2.1.). 

Moderní přístroje nabízejí možnost modifikovat sterilizační teplotu, dobu sterilizace apod., umožňují tak sterilizaci i náchylnějších složek kultivačních médií, jakými jsou například sacharidy. Ke kontrole, zda celý sterilizační cyklus proběhl, slouží indikační pásky, u kterých dochází k barevné změně. Stejně jako v případě horkovzdušných sterilizátorů je u autoklávů po dokončení cyklu důležité otevírat komoru až při poklesu teploty (většinou pod 85 °C), aby nedošlo ke kontaminaci z vnějšího prostředí díky proudění horkého vzduchu z přístroje. Autoklávy jsou tlakové nádoby, a proto práce s nimi vyžaduje dodržování základních pravidel, aby se při jejich využívání předcházelo riziku poškození přístroje nebo úrazu. Základní pravidla pro práci s autoklávem zahrnují:

1. Nikdy neotvírat přístroj, dokud neklesne teplota a tlak v přístroji na bezpečnou hodnotu.

2. Při sterilizaci pomůcek je důležité, aby docházelo ke kontaktu pomůcek s horkou párou, která je hlavním sterilizačním prvek. Nadbytečné a často téměř neprodyšné balení pomůcek snižuje efektivnost sterilizačního procesu (např. krabičky špiček zabalené dodatečně ještě v hliníkové folii). 

3. Při sterilizaci tekutých médií, vč. médií s agarem, se doporučuje naplňovat nádoby maximálně do ¾ jejich objemu.

4. Při využívání teplotního čidla (u moderních autoklávů) během sterilizace tekutých médií je nutné čidlo umístit do referenční nádoby s destilovanou vodou, jejíž objem odpovídá maximálnímu sterilizovanému objemu.

5. Při autoklávování v nádobách se šroubovacími uzávěry je nutné tyto uzávěry povolit alespoň o jednu otáčku.

6. Mezi pomůckami v autoklávu by měly být mezery, aby docházelo k rovnoměrnému proudění horké páry. Při přeplnění autoklávu nemusí být sterilizace dostatečná, případně vůbec nemusí proběhnout sterilizační cyklus.

Filtrace

Filtrace se využívá především pro sterilizaci látek, které při vysokých teplotách degradují (např. vitamíny, antibiotika, proteiny apod.), současně lze tuto metodu využít i pro šetrnou sterilizaci přírodní vody, což se často doporučuje především pro mořskou vodu. Sterilizaci filtrací lze provádět na speciálních aparaturách pro membránovou filtraci nebo s využitím filtračních nástavců pro injekční stříkačky. Jedná se o efektivní a rychlou metodu, jediné potenciální riziko představují drobní heterotrofní bičíkovci, kteří mohou přes póry filtrů proniknout do sterilního roztoku. V případě, že se využívá této metody ke sterilizaci viskózních látek, doporučuje se tyto látky přefiltrovat na hrubších filtrech před vlastní sterilizací. 

Membránová filtrace se provádí na speciálních aparaturách, které jsou buď skleněné nebo plastové, vyrobené z autoklávovatelných plastů a tento typ sterilizace je vhodný pro větší objemy. Sterilizace probíhá přes připravenou aparaturu do sterilní nádoby (aparatury jsou kompatibilní s klasickými skleněnými lahvemi s GL45 uzávěrem), do které je sterilizovaný roztok přefiltrovaný působením podtlaku vzniklého připojením aparatury na vývěvu (Obr. 2.5.). Do olivky sloužící k připojení vývěvy je důležité před autoklávování vložit vatovou ucpávku pro eliminování případné kontaminace z přívodní hadice vývěvy, současně je vhodné pro snížení rizik kontaminace provádět celou filtraci v laminárním boxu. 

Filtry pro membránovou filtraci se vyrábějí z různých materiálů (např. acetát celulózy, estery celulózy, nylon, polytetrafluorethylen, polykarbonáty apod.), pro filtraci vodných roztoků se nejčastěji používají filtry z esterů celulózy, nitrátu celulózy nebo acetátu celulózy. Tyto filtry se buď dodávají sterilní anebo je lze sterilizovat autoklávováním. Nejčastěji používané filtry jsou typy s velikostí pórů 0,22 μm a 0,45 μm.  

Pro sterilizaci menších objemů se využívají filtrační nástavce na injekční stříkačky (Obr. 2.6.), které v závislosti na svém průměru umožňují filtrace objemů od 1 ml až 100 ml, v některých případech i větší. Podobně jako filtry pro membránovou filtraci se filtrační nástavce vyrábějí z různých materiálů, jejichž využití je podobné jako u filtrů pro membránovou filtraci, stejně tak jako velikost pórů a 0,22 μm nebo 0,45 μm. Vlastní sterilizace probíhá podobně jako v případě předchozí membránové filtrace – v laminárním boxu je sterilizovaný roztok protlačen injekční stříkačkou přes filtrační nástavec do připravené sterilní nádoby. 

Elektromagnetické vlny

Pro sterilizaci lze také využívat některé části elektromagnetického spektra (elektromagnetických vln). Většinou se sterilizace pomocí těchto vln využívá jako alternativy k některým jiným metodám nebo jako jejich doplněk. Nejčastěji se využívá mikrovlnného, ultrafialového a gama záření (Obr. 2.7.). 

Mikrovlnného záření se využívá především při sterilizaci malých objemů kapalin, případně skleněných pomůcek. Jedná se spíše o alternativní metodu než metodu, která by byla rutinně používána v mikrobiologických disciplínách. Obvykle lze mikrovlnami efektivně sterilizovat objemy od 500 do 1500 ml. Délka sterilizace tekutých médií je doporučena na 10 minut při 750 W nebo při 600 W po dobu 5 minut s přestávkami. V dnešní době lze zakoupit mikrovlnné sterilizátory určené pro tekutá média, avšak i tyto sterilizátory jsou limitovány objemem, např. mikrovlnný sterilizátor Microject umožňuje sterilizaci maximálně 500 ml média. Při sterilizaci skleněných pomůcek se uvádí 45 minut při 600 W, případně 20 při 600 W, pokud se k pomůckám přidá malé množství destilované vody. Ke sterilizaci pomůcek lze využít také komerčně vyráběných parních sterilizátorů, určených pro mikrovlnné trouby. 

Ke sterilizaci především pracovních ploch nebo místností se využívá především ultrafialové záření, které představuje neionizující záření. Ultrafialové záření se dělí v závislosti na své vlnové délce na blízké UV (400 - 200 nm), dlouhovlnné (UV-A, 400 - 315 nm), středněvlnné (UV-B, 315 - 280 nm), krátkovlnné (UV-C, pod 280 nm) apod. Pro sterilizaci se využívají především germicidní zářivky, které produkují UV-C záření, tento typ záření ve srovnání s ostatními typy UV záření proniká efektivně do hloubky živých tkání, kde způsobuje především poškození molekul DNA. Při UV-C záření vzniká ozón – na to je třeba pamatovat při využívání germicidních zářivek v místnostech a nevystavovat se zbytečně vzniklému ozonu, který může mít negativní vliv na lidské zdraví. Současně je nutné vyvarovat se využívání dezinfekčních prostředků na bázi chlornanů, jejichž reakcí s UV-C záření vzniká chlor a chlorové sloučeniny, které mohou mít opět negativní vliv na lidské zdraví. Dostatečná doba působení germicidních zářivek se pohybuje v rozmezí 30 - 60 minut. Protože tento typ neprochází sklem a většinou plastů, lze jej využívat i ke sterilizaci prostředí v kultivačních místnostech. Germicidního UV-C záření lze také využívat ke sterilizaci pomůcek, např. podložních sklíček pro izolace, plastových Petriho misek apod. Nevýhodou tohoto záření je efekt jeho dlouhodobého působení na plastové pomůcky, které většinou křehnou a žloutnou. 

Ke sterilizaci lze využít také ionizujícího záření (např. gama záření), které na rozdíl od neionizujícího záření ničí molekuly DNA. V mikrobiologii se používá především ke sterilizaci jednorázových plastových pomůcek, ale v současné době je v některých případech nahrazováno jinými metodami. 

Chemická sterilizace

Chemické sterilizace se využívá především pro pomůcky, které nesnesou vysoké teploty a také k dezinfekci pracovních ploch. Dříve se metody chemické sterilizace používaly mnohem častěji, ale postupně se od nich upustilo, především proto, že se k tomuto účelu byly využívány různé toxické látky. Spektrum látek, které lze využít při chemické sterilizaci je poměrně široké a zahrnuje fenoly a fenolické látky, halogeny a na nich založené sloučeniny, alkoholy, aldehydy, sloučeniny obsahující těžké kovy, různé plynné látky apod. Tyto přípravky působí negativně na některé buněčné procesy (např. prasknutí buněčné stěny, denaturace enzymů a proteinů, inhibice metabolismu) a eliminují tak jednotlivé mikroorganismy. 

Ke sterilizaci pomůcek, které nebylo možné sterilizovat s využitím vyšších teplot, se dříve používal ethylenoxid [oxiran, (CH2)2O] – tato sloučenina je toxická, extrémně hořlavá látka, její páry mohou snadno explodovat. V současné době je využíván v různých průmyslových odvětvích a jako sterilizační médium pro některé lékařské pomůcky a nástroje. Pro sterilizaci plastu (například Petriho misek, jamkových destiček apod.) se využívá kyselina peroxooctová (kyselina peroctová, CH3COOOH), která je součástí komerčního prostředku Persteril® 36, což je stabilizovaná směs 36 % kyseliny peroxooctové a peroxidu vodíku, kyseliny octové a vody. Sterilizace plastových pomůcek s využitím Persterilu se provádí v těsnících plastových boxech nebo pytlích, do kterých se ke sterilizovaným pomůckám přidá nádobka s vatou s několika mililitry Persterilu. Vzhledem k reaktivní povaze látky je sterilizace poměrně rychlá a účinná a po několika hodinách působení jsou pomůcky sterilní a po vyfoukání přebytečného aerosolu v laminárním boxu jsou připraveny k použití. Kyselina peroxooctová se rozkládá na málo nebezpečné látky a proto mají přípravky na bází této sloučeniny široké použití od mikrobiologie, přes potravinářství, zemědělství až po lékařství. 

Především ve velkoobjemových kultivacích a marikulturách se používá jako sterilizační činidlo kultivačních zařízení chlornan sodný (NaClO), který je běžnou součástí bělících a dezinfekčních prostředků (komerčně dodávaný jako SAVO®, které obsahuje přibližně 4,7 % chlornanu sodného). Sterilizace probíhá několikahodinovým působením zředěného komerčního roztoku a jeho následné neutralizace (například thiosíranem sodným, Na2S2O3.5H2O). V běžné mikrobiologické praxi se využívá spíše jako dezinfekční prostředek na plochy a pracovní povrchy, případně k likvidaci biologického odpadu. Aplikaci chlornanu sodného mohou přežít některé rezistentní spory. Ve velkoobjemových kultivacích se také provádí sterilizace fotobioreaktorů koncentrovanějšími roztoky peroxidu vodíku (H2O2), v jiných případech se peroxid při práci s kulturami sinic a řas téměř nepoužívá. 

Jako antiseptické a dezinfekční prostředky se využívají také 0,1% roztok chloridu rtuťnatého (sublimát, HgCl2), 3% roztok fenolu (karbol, kyselina karbolová, C6H5OH), 3 - 5 % roztok kresolu (saponated cresol solution, C7H8O) nebo 2 - 5% glutaraldehydu [pantandial, (CHO)CH2CH2CH2(CHO)] nebo formaldehydu (methanal, HCHO). Všechny tyto látky představují nebezpečné, a především toxické sloučeniny a nejsou rutinně využívány. Mohou být využívány ve specifických případech (například formaldehydové pumpy v biohazard laminárních boxech). Nejčastěji se pro chemickou sterilizaci využívají různě koncentrované roztoky ethanolu (ethylalkohol, C2H5OH), proti působení ethanolu jsou však mnohé mikroorganismy odolné. Pro chemickou sterilizaci lze také využívat komerčně dodávaných prostředků (např. Desprej, Chloramin T apod.) - všechny tyto prostředky je vhodné při jejich používání střídat, aby se snížilo riziko vzniku rezistence mikroorganismů na tyto přípravky.

Laminární boxy (Flow boxy)

Laminární boxy (flow boxy) jsou nepostradatelnou součástí většiny laboratoří, které pracují s mikroorganismy anebo s in vivo udržovanými kulturami rostlin, živočišných tkání apod. Výběr těchto boxů se odvozuje od materiálu, se kterým se pracuje, především v souvislosti jeho patogenitou (kategorie biosafety level, BSL, viz Box 2.1.).  Běžná práce s kulturami sinic a řas nespadá do žádné z kategorií BSL, a tudíž práce s takovým typem materiálu nevyžaduje žádné speciální vybavení, spojené s ochranou osob a dekontaminací pomůcek a materiálu; výjimkou jsou patogenní řasy, například při práci s kulturami Prototheca zopfii (tř. Trebouxiophyceae, ř. Chlorellales) platí pravidla v rámci BSL2. 

Základní součástí laminárních boxů je tzv. HEPA filtr (high efficiency particulate arrestance filter), který se vyznačuje extrémně vysokou účinností zachytávání částic ze vzduchu, např. 99,97% účinnost pro částice o velikosti 300 nm, platí tedy, že čím větší částice, s tím větší účinností je HEPA filtrem zachycena. Vlastní filtr představuje jakýsi chomáč náhodně uspořádaných vláken a o jeho efektivnosti rozhoduje především šířka těchto vláken, jejich vzájemná vzdálenost a také tloušťka celého filtru. Díky těmto vlastnostem zajišťuje HEPA filtr proudění čistého filtrovaného vzduchu do pracovního prostoru laminárního boxu. 

Vlastní laminární boxy se skládají z ventilátoru nasávajícího vzduch z místnosti, který je často ještě nahrubo filtrovaný na tzv. předfiltru a poté je vzduch hnán přes HEPA filtr do pracovního prostoru boxu. Podle typu proudění se laminární boxy dělí na horizontální a vertikální (viz Obr. 2.8.). Často jsou součástí laminárních boxů germicidní UV-C zářivky, které dále zvyšují sterilitu pracovního prostředí.

Práce v laminárních boxech má svá pravidla, která snižují kontaminaci pracovního prostoru boxu a také mikrobiálních kultur se kterými je v boxech pracováno. Vždy je nutné mít na paměti existenci tzv. gradientu sterility a dodržovat rozmístění pomůcek a kultur především v zadních dvou třetinách pracovní plochy boxu. Detailně se práci v laminárních boxech věnuje kapitola 14.1.