ALGOLOGICKÉ KULTIVAČNÍ TECHNIKY

Udržovaní kultur sinic a řas

Vhodné podmínky kultivačních prostor jsou důležité pro dlouhodobé udržování kultur sinic a řas. Hlavními kritérii jsou vhodné kultivační prostory (místnosti nebo speciální kultivační boxy) a vhodné podmínky, z nichž nejzásadnější jsou teplota a osvětlení, které jsou spojené také s péčí o jednotlivé kultury. Při dlouhodobém udržování kultur je nutné brát v potaz případnou morfologickou změnu u kultivovaných organismů, často související s výběrem kultivačního média, někdy však mohou být podmíněny i jinými faktory, určitou roli zde může hrát i genetické pozadí.

Kultivační podmínky

Kultivační podmínky vyhovující kultivovaným kulturám sinic a řas jsou zásadní podmínky pro úspěšné dlouhodobé udržování těchto organismů, hlavními podmínkami jsou teplota, světlo, dostatek živin, pH a v případě některých organismů také promíchávání kultur. Nedostatky v některém z těchto faktorů mohou způsobit fyziologický stres a v krajních případech i odumření kultury.

Nejvhodnější pro udržování kultur sinic a řas jsou specializované místnosti s konstantní teplotou, vhodným osvětlením apod. Pokud to není z prostorových důvodu možné, lze kultury udržovat v prosklených lednicích při nízkých teplotách anebo využívat speciálních boxů s řízenou teplotou a osvětlením, tyto boxy jsou však poměrně drahé. Ve všech případech hraje roli kromě podmínek optimálních pro růst kultur také čistota prostředí, která je důležitá jako prevence různých typů kontaminací. Nejčastějším způsobem udržování čistého prostředí je instalace germicidních UV-C zářivek do kultivačních místností, nebo místností, kde jsou umístěny lednice či boxy s kulturami. Dalším vhodným způsobem pro udržení čistého prostředí je aplikace fotokatalytického nátěru stropu na bázi oxidu titaničitého (TiO2) – tato látka působí za přítomnosti ultrafialového záření jako fotokatalyzátor a je schopna oxidace organických látek, např. částic prachu, spor apod., čímž čistí vzduch v místnosti. V některých případech je před vstupem do vlastních kultivačních prostor zavedena tzv. hygienická smyčka, která slouží pro převlečení nebo přezutí osob vstupujících do kultivačních prostor. V případě práce se sinicemi a řasami je dostačující přezutí obuvi a případná instalace speciálních lepících dekontaminačních rohoží před vstupní dveře do kultivačních prostor. Schéma možného uspořádání kultivačních prostor je na Obr. 7.1.

Obr. 7.1. Příklad uspořádání kultivačních místností ve Sbírce autotrofních organismů (Botanický ústav AV ČR, Třeboň)

Obr. 7.2. Kultury z polárních oblastí udržované v prosklené lednici (teplota 7 °C) s dodatečným LED osvětlením.

Obr. 7.3. Kultury udržované ve speciálním kultivačním boxu s regulovanou teplotou a osvětlením.

Vhodná teplota pro udržování sinic a řas z temperátní oblasti se pohybuje v rozmezí 10 °C až 25 °C, tropické izoláty je vhodné udržovat při teplotách vyšších než 20 °C. Většinu sinic a řas v kulturách je možné udržovat v teplotách v rozmezí mezi 16 °C a 27 °C, nejčastějším rozmezím teplot je 18 °C až 20 °C. Existují také organismy pocházející z prostředí s výrazně nižšími nebo vyššími teplotami, např. izoláty z polárních oblastí je nutné udržovat při teplotě pod 10 °C, nejlépe v prosklených lednicích s dodatečných osvětlením (Obr. 7.2.) a v případě práce s kulturami organismů, které pocházejí z biotopů s vysokou teplotou (nejčastěji teploty vyšší než 35 °C) je potřeba udržovat ve speciálních kultivačních boxech (Obr. 7.3.), kde je konstantní teplota, osvětlení a vzdušná vlhkost (Barsanti & Gualtieri, 2014). Teplotní režim bývá většinou konstantně nastaven, důležité je vybrat takový systém pro udržování teploty, kdy nedochází k výrazným teplotním výkyvům, které mohou způsobit teplotní stres, především u citlivějších organismů. Pokud to možnosti dovolují, je nejvhodnější mít více kultivačních místností s různými teplotními režimy.

Dalším důležitým faktorem je vhodné osvětlení, jehož intenzita hraje nejdůležitější roli v dlouhodobém udržováním kultur sinic a řas. Nejčastější rozmezí intenzity osvětlení se pohybuje mezi 10 - 30 µmol.m-2.s-1, sinice a některé řasy, které mají fykobilózmy vyžadují nižší intenzitu osvětlení (kolem 10 µmol.m-2.s-1), naopak obrněnky vyžadují intenzivnější osvětlení (60 – 100 µmol.m-2.s-1), většina apochlorických zástupců vyžaduje kultivaci ve tmě (Barsanti & Gualtieri, 2014, Lorenz et al., 2005). Dříve rozšířené žárovkové osvětlení, bylo postupně nahrazováno klasickými zářivkami, případně se tyto dva světelné zdroje využívali v kombinacích (Obr. 7.4., 7.5.). Nevýhodou těchto světelných zdrojů je jejich výhřevnost a obtížná regulovatelnost. V dnešní době je možné využívat zářivek, ve kterých jsou jako zdroj světla LED diody. Výhodou tohoto zdroje světla jsou menší energetické náklady a menší výhřevnost, lze využít různě dlouhých zářivek, které lze vzájemně spojovat a získat modulární zdroj osvětlení, kde míru osvětlením regulovat vypínám jednotlivých trubic (Obr. 7.5.), v některých případech lze využívat i LED zářivek, které produkují spektrum vyhovující sinicím a řasám, tedy zářivky emitující osvětlení v modrém a červeném spektru. Nejmodernější technologie nabízí využívání LED osvětlení v podobě pásků nebo panelů, které je navrženo přesně pro potřeby kultivovaných organismů.

Obr. 7.4. Kultury v kultivační místnosti s kombinovaným osvětlením – klasické žárovky a zářivky (fotografie J. Lukavský)

Obr. 7.5. Kultury v kultivační místnosti osvětlené systémem LED zářivek, prosklené police pomáhají lepší distribuci světla.

Je nutné brát v potaz, že příliš intenzivní osvětlení může vést k fotoinhibici, ta může nastat v případě umístění kultur na přímé sluneční světlo nebo příliš blízko k umělému zdroji osvětlení, to je častý problém u klasických zářivek (a dříve i žárovek). Současně je důležitý světelný režim, nevhodná světelná perioda může vést k nechtěným fotoperiodickým efektům, například tvorba cyst. Nejčastější světelné režimy, tj. poměr světlo:tma jsou, 12:12 nebo 14:10, v některých případech až 16:8 (Barsanti & Gualtieri, 2014, Lorenz et al., 2005).

V případě kultur některých řas je potřebné promíchávání, aby nedocházelo k fotoinhibici spojené se vzájemným si stíněním, tento problém se vyskytuje především u kultur, které rychle sedimentují. V závislosti na objemu kultury je dostatečné občasné promíchání obsahu baňky ručním kroužením baňky, nebo umístěním kultur na laboratorní třepačku, která je promíchává buď kontinuálně (ne všechny kultury však tento typ míchání snášejí) nebo v pravidelných intervalech během dne. V případě větších objemů se využívá problublávání kultur vzduchem s přídavkem oxidu uhličitého.

Změny pH mohou probíhat v případě, že kultura začne dosahovat nosné kapacity prostředí, tedy začne vyčerpávat živiny a většinou při těchto koncentracích dojde k nárůstu pH díky fotosyntéze, případně mohou změny pH nastávat u dna kultivačních nádob při nadměrné sedimentaci řas. Obecně lze říci, že sladkovodní řasy preferují kyselejší pH (5 – 7), oproti tomu sinice pH zásaditější v rozmezí 7 – 9 (Lorenz et al., 2005).

Práce s kulturami

Kultury sinic a řas se nejčastěji udržují na médiích ztužených agarem ve zkumavkách anebo v tekutých médiích v Erlenmeyerových baňkách o objemu 50 – 250 ml. Při udržování kultur ve zkumavkách se šikmým agarem se využívá různých typů uzávěrů, od zátek z buničité vaty, které mají výhodu v dobré propustnosti pro plyny, ale současně v nich kultury relativně rychle vysychají, přes různé typy kovových uzávěrů (Obr. 7.6. a 7.7.) až po plastové šroubovací uzávěry (Obr. 7.8.). Při přípravě zkumavek se šikmým agarem je vhodné mít kultivační plochu v rozumném rozměru, pokud jsou kultivační plochy příliš velké, zkumavky rychle vysychají, pokud jsou kultivační plošky naopak příliš malé, jsou rychle porostlé. Při udržování kultur ve zkumavkách je potřeba zajistit, aby všechny kultury měly dostatek světla, buď vhodným uspořádáním ve stojáncích (Obr. 7.8.) nebo zavěšením na speciálních žebřících (Obr. 7.9.), tento typ udržování kultur je však náročný na prostor. Erlenmeyerovy baňky jsou nejčastěji uzavřené zátkou z buničité vaty, která je buď připravená ze smotané vaty (Obr. 7.10.) nebo jsou používány komerčně dodávané vatové špunty různých rozměrů podle hrdla kultivační nádoby – tyto zátky dobře umožňují výměnu plynů, dříve byly zátky ještě přetahovány pergamenovým papírem, který snižoval výpar a současně fungoval jako bariéra pro případné kontaminace. Méně často se používají baňky se šroubovacím nebo kovovým uzávěrem (především z důvodů vysoké ceny) nebo různé typy zátek z plastu. Nepříliš vhodné je udržování kultur v baňkách, jejichž hrdlo je přetažené hliníkovou fólií, se kterou se hůře pracuje, protože se lehce protrhává a současně zvyšuje riziko různých kontaminací. U kultur v tekutých médiích je, stejně jako u kultur ve zkumavkách s agarem, potřeba zajistit, aby všechny kultury měly dostatek světla.

Obr. 7.6. Kultury ve zkumavkách s hliníkovým uzávěrem

Obr. 7.8. Kultury ve zkumavkách se šroubovacích uzávěrem ve stojáncích

Obr. 7.7. Kultury ve zkumavkách s kovovým nasazovacím uzávěrem

Obr. 7.10. Kultury v tekutém médiu v Erlenmeyerových baňkách, vatové zátky kryté pergamenovým papírem

Obr. 7.9. Kultury ve zkumavkách se zavěšené na kovových žebřících

Kultury by měly být pravidelně přeočkovávány do čerstvých kultivačních médií, očkovací interval je ovlivňován typem kultury a také podmínkami (především teplotními), ve kterých je udržován. K přeočkovávání by mělo dojít nejpozději do konce exponenciální fáze svého růstu. Interval pro přeočkování se mezi jednotlivými skupinami liší, v delších intervalech lze přeočkovávat kultury sinic (např. u kultur udržovaných ve zkumavkách s agarem při nižších teplotách je dostačující přeočkování jednou za půl roku), u řas se intervaly poměrně liší, obecně by se měly kultury řas přeočkovávat za 2 – 3 měsíce, ovšem u některých citlivých druhů mohou být očkovací intervaly v týdnech nebo v měsících, jako například u planktonních řas. Během přeočkování do nového média je potřeba přenést dostatek inokula, inokulum by mělo představovat zhruba 1 – 10 % (v/v) původního objemu kultury a v případě některých citlivých organismů (např. Synechococcus, Prochlorococcus nebo někteří bičíkovci) by měl být objem inokula až 25 % (v/v) (Lorenz et al., 2005).

Při práci s kulturami je potřeba dodržovat pravidla sterilní práce (viz Kapitoly 2. a 14.1). Při přeočkování kultur rostoucích ve zkumavkách se šikmým agarem se biomasa přenáší nejčastěji klasickou mikrobiologickou kličkou, kterou je v nové zkumavce co nejvíce rovnoměrně rozetřená. U některých sinic, které prorůstají dovnitř do agaru, se vyřízne kultura s malým kouskem agaru, buď očkovací kličkou nebo vytaženou skleněnou kapilárou, a ten se přenese do nové zkumavky. Pro přenos sinic a řas kultur udržovaných v tekutých médiích se nejčastěji používají skleněné trubičky nebo Pasteurovy pipety s vatovou zátkou, případně automatické pipety se špičkami s filtrem. Vláknité řasy se nejčastěji přeočkovávají s použitím pipety, případně v použitím kovového háčku nebo sterilních špejlí. U řas a sinic, které mají v tekutých médiích tendenci porůstat dno nádob je možné používat skleněné kuličky, které se pak přenesou do nového média.

Po přeočkování je vhodné udržovat kultury po nějakou dobou v “přívětivějších” podmínkách, než za kterých jsou dlouhodobě udržovány, především při mírnějším osvětlení, aby nedocházelo ke zbytečnému stresu v naředěném inokulu během aklimatizační fáze (viz Kapitola 10).

Pokud se inokulum nebo čerstvý izolát v nových podmínkách neuchytí nebo kultura při dlouhodobější udržování neprosperuje, může to být způsobeno několika faktory (viz Box 7.1.), pro eliminaci těchto problémů je důležitá znalost biologie a ekologie organismů, což často vyžaduje studium různých publikací, případně hledání informací v katalozích sbírek.

Box 7.1. Problémy spojené s kultivací sinic a řas

Pokud vyizolované, udržované nebo přeočkované kultury nerostou, může to být způsobeno několika faktory:

  1. Nevhodné médium.

  2. Chyba při přípravě média:

    • špatně namíchané médium;

    • vysrážení média během autoklávování a následná limitace kultury živinami;

    • nevhodné pH média;

    • chybějící složka média (například nedodání vitamínů nebo křemíku pro některé skupiny řas).

  3. Kvalita kultury:

    • nedostatečné množství inokula;

    • očkování ze staré, strádající kultury.

  4. Kultivační podmínky:

    • vysoká/nízká teplota;

    • přesvícení nebo nedostatek světla (špatné nastavení časovačů);

    • nevhodná fotoperioda.

Genetické pozadí morfologických změn

Přestože kultivační média používaná pro udržování kultur sinic a řas by měla co nejvíce vyhovovat udržovaným organismům z hlediska jejich fyziologie, reflektováním jejich ekologických požadavků v přírodních podmínkách dochází často ke změnám v morfologii dlouhodobě udržovaných kmenů. Za některé morfologické změny může být také zodpovědné i genetické pozadí (viz Box 7.2.)

Box 7. 2. Genetické pozadí morfologických změn

Vlákno na síti Researchgate k dotazu ohledně možné kontaminace kultury Arthrospira (Spirulina):

Contamination of Spirulina platensis Culture by Oscillatoria

T. J. “We are trying to mass produce Spirulina platensis in our college laboratory. We are facing contamination of Oscillatoria sp. in our culture medium. If anyone knows any method to remove Oscillatoria contamination do help.”

R. R. “I have same problem in Spirulina cultivation”

N. R. “Are you sure that you observe contamination or it could be just morphological changes?”

P.J. “That is common that Arthrospira/Spirulina filaments in culture change their morphology, I have this experience with strains in our collection.”

Jedná se skutečně o změnu morfologie a její otázce se detailně věnovali Wang & Zhao (2005), kdy zjistili, že vlákna Spirulina platensis mohou spontánně změnit svojí morfologii z rovného typu vláken do helikálně stočených vláken, která se o původních rovných vláken lišila morfologií, ultrastrukturou i biochemicky, např. exprese některých proteinů se lišily u rovných a stočených vláken.

Obr. 7.11. Limnospira maxima, izoláty z Čadu kultivované za stejných podmínek, spirální forma (kmen CCALA 27) a rovná forma (kmen CCALA 28).

Výsledky mnoha studií ukazují, že kultury mění svou morfologii, a to buď díky změnám během dlouhodobého udržování, nebo díky změnám ve složení média. Souhrnně se problematice morfologických změn u řas věnoval například Trainor et al. (1971), který uvádí poměrně široké spektrum příkladů (viz tabulka 7.1.).

Rod

Ankistrodesmus

Coelastrum

Gonium

Golenkinia

Stigeoclonium

Draparnaldia

Scene/Desmodesmus

Morfologické změny

produkce forem připomínajících jiné rody

heterotrofní růst omezoval tvorbu kolonií

Coelastrum proboscideum produkovalo formy připomínající jiné rody v závislosti na živinách omezování formací kolonií nedostatkem železa nebo vápníku

formy bez trnů (s výjimkou bifázických půdních médií)

větvené a nevětvené formy

Stigeoclonium-like při dostatku dusičnanů, typická forma v podmínkách s nižším obsahem dusičnanů

tvorba jednobuněčných forem ovlivňována vápníkem,
tvorba jednobuněčných Chodatella podobných stádií v různých typech kultur,
Franceia podobné formy v kulturách bez amoniaku,
formy s trny nebo bez trnů

Detailně se morfologické variabilitě řas věnovali Prát et al. (1972), jejichž výzkum se soustředil na několik řasových rodů kultivovaných v různých typech médií a uvádějí následující morfologické změny, především změnu barvy, kterou vykazovaly některé kultury udržované na médiu s glukózou (např. některé druhy rodu Chlorella, Desmodesmus quadricauda), u některých stárnoucích kultur dochází k přirozené barevné změně nejčastěji v odstínu žluté, přes oranžovou až po červenou (např. typicky Haematococcus nebo Vischeria punctata, Protosiphon botryodies, Coelastrum, někteří zástupci rodu Scedenedemus), barevná změna je také typická pro stárnoucí kultury půdních zelených kokálních řas.

Dalším poměrně běžným jevem je ztráta koloniálnosti, např. zástupci rodu Coelastrum, Pediastrum a některé druhy rodu Scenedesmus. Stejně tak ztráta bičíků u některých bičíkatých řas, například někteří zástupci Chlamydomonas, to může být často způsobeno nevhodnou fotoperiodou.

Morfologickou komplexitu na příkladu zelené řasy Desmodesmus v kulturách studoval Trainor et al. (1976), kultury vykazují typické čtyřbuněčné kolonie, ale stejně tak jednobuněčné formy, podobající se jiným druhům zelených řas (Obr. 7.12.). Studie dále ukazuje, že některé druhy jsou v kulturách schopny redukovat počet svých trnů, v hraničních případech až na formy zcela bez trnů, stejně tak je dokládána variabilita v délce trnů, mnohdy až s drastickou redukcí, ale nikdy o trny zcela nepřijdou.

Podobně Otsuka et al. (2000) sledovali morfologickou variabilitu kultur několika druhů rodu Microcystis, většina sledovaných kultur si udržovala typickou morfologii, na druhou stranu některé druhy vykazovaly výraznou morfologickou variabilitu, jako například druh Microcystis wesenbergii.

Obr. 7.12. Morfologická variabilita pozorovaná v kulturách zelené řasy Desmodesmus. Nahoře typická forma (vlevo) a tzv. Chodatella quadriseta typ (vpravo), uprostřed Scenedesmus longus (vlevo) a Chodatella subsalsa (vpravo) typ, dole Scenedesmus abundans (vlevo) a Franceia sp. (vpravo) typ (Trainor et al., 1976).

Obr. 7.13. Typická morfologie Microcystis wesenbergii (foto J. Kaštovský)

Obr. 7.14. Variabilita kolonií Microcystis wesenbergii (Otsuka et al., 2000).