ALGOLOGICKÉ KULTIVAČNÍ TECHNIKY

Tradiční metody izolace mikrořas

Centrifugace a sedimentace

Využití těchto metod ve většině případů nepovede k získání zcela čisté kultury, ale obě metody mohou sloužit jako izolační předstupeň pro některou z výše uvedených metod.

Centrifugaci lze využít ke klasickému zahuštění biomasy větších sinic a řas vzorku do peletu, následné rozpuštění a další série centrifugací, tímto lze ze vzorku často eliminovat bakterie nebo drobnější řasy, které zůstanou v odpadním supernatantu. Tato metoda může být úspěšná také při izolaci bičíkovců (např. obrněnky), z nichž někteří jsou schopni rychle vyplavat do supernatantu. Důležité je při použití centrifugace správné nastavení otáček tak, aby nedošlo k poškození buněk během centrifugace. Metoda centrifugace může být problematická u sinic s aerotopy.

Pro velké neplovoucí organismy lze využít opakované sedimentace vzorku a následné přímé izolování některou z uvedených metod. K sedimentaci lze využít buď speciální konické válce nebo klasické laboratorní válce.


Využití fototaxe

U řas schopných fototaxe je možné jako předizolační metodu využít zakoncentrování jejich biomasy s využitím světla. Tato metoda může sloužit k zakoncentrování cílového organismu pro je následnou izolaci, pokud je daný organismus ve vzorku zastoupen pouze řídce anebo oddělení organismu od jiných nepohyblivých sinic a řas ve vzorku a následné izolování některou z metod. Realizace může být provedena jednoduše u vzorků v tekutém médiu ve zkumavce, jejíž výrazná část je zakrytá a ke koncentraci dochází v nejhornější osvětlené části zkumavky, případně na Petriho misce (viz Obr. 4.5.) s využitím umělého zdroje světla.

Při využití fototaxe je důležité mít na paměti, že osvětlení by nemělo být příliš silné, při příliš silném osvětlení mohou řasy vykazovat negativní fototaxi, ideální je umístění vzorku na severní okno a sledovat postupné hromadění fototaktických řas.


Obr. 4.5. Akumulace zelených bičíkovců rodu Chlamydomonas způsobená pozitivní fototaxí (Okita et al., 2005, upraveno).

Mohou být využity také různě sofistikované aparatury, jak ukazuje Obr. 4.6. – pipeta s vyfouknutými dutinami je naplněna kultivačním médiem, následně je nasát vzorek obsahující bičíkovce tak, aby zaplnil zhruba polovinu první dutiny (té nejblíže ke špičce), poté je pipeta umístěná vodorovně vůči zdroji světla (sluneční světlo nebo umělé osvětlení), směřování v závislosti na pozitivní nebo negativní fototaxi zájmových řas. Po zhruba 30 - 120 minutách dochází k akumulaci bičíkovců v poslední dutině, následně je pipeta odlomena (na obrázku označeno šipkou) a obsah dutiny je přelitý do zkumavky s kultivačním médiem (Stein et al., 1973).

Obr. 4.6. Pipeta upravená pro izolaci bičíkovců s využitím fototaxe (Stein et al., 1973).

Speciální metody

Vzhledem k množství biotopů a společenstev, které sinice a řasy osídlily, nejsou výše uvedené “rutinní” metody vždy použitelné anebo jejich použití nemusí být zcela efektivní, pro některá společenstva jsou uvedené speciální metodiky, jak organismy v nich žijící získat do kultur.

Epifytická společenstva, která rostou na ponořených rostlinách lze získat do kultury prostým šeškrabem z povrchu rostliny a izolovat dalšími běžnými metodami. Pro sinice a řasy rostoucí na povrchu například vláknitých řas je ideální vzorek umístit do ultrazvukové lázně, kdy dojde k setřesení epifytů a ty mohou být následně izolovány, stejně tak lze tuto metodu použít pro nárosty na makrofytech a získat tak větší množství materiálu než při pouhém seškrabování. Další nárostová společenstva, kde řasy poměrně dominují, jsou epipelon (tj. organismy žijící v jemném dnovém sedimentu) a epipsanom (organismy rostoucí na zrnkách písku), ty vyžadují také některé kroky před vlastní izolací. V případě epipsamických společenstev je možné izolovat celá zrníčka písku, následně je kultivovat v obohacené kultuře a pak izolovat. Sinice a řasy v epipelonním společenstvu lze izolovat zalitím sedimentu médiem a kultivace za vhodných podmínek, kdy dochází k migraci organismů z vodního sloupce a je možné je následně izolovat. Stejně tak je možné využít sterilních plovoucích krycích sklíček, která budou někteří zástupci z epipelonu porůstat a následně z nich mohou být izolovány, stejně tak je možné překrýt zalitý sediment sterilní gázou, kterou lze pak po narostení otisknout na agarovou plotnu v Petriho miskách a následně izolovat vzrostlé kolonie, případně ji proprat v tekutém médiu a ze vzniklé směsné kultury dále izolovat.

Některé řasy, například obrněnky rodů Amphidinium a Spiniferodinium, mají tendenci rychlého přisedání k substrátu, což komplikuje jejich izolaci. K uvolnění ze substrátu může dojít pomocí ultrazvuku nebo proudem vytvořeného pomocí mikropipety, vždy je však nutné pracovat rychle. Případně je možné okolí přisedlé řasy (nejlépe v plastové misce) očistit nahrubo jemným štětcem a jemněji pomocí mikropipety, následně část s přisedlou buňkou vyříznout a kultivovat (Andersen & Kawachi, 2005).

Ve vzduchu volně unášené řasy a sinice, tzv. aeroplankton, lze izolovat do kultur běžnými metodami, ve spojení s tímto společenstvem je důležitý odběr vzorků vzduchu. Jednoduchou metodou je modifikace klasické mikrobiologické metody – spadové metody – kdy jsou otevřené Petriho misky exponovány po nějaký čas a následně jsou kultivovány ve vhodných podmínkách. Tato metoda je rutinně používána při zjišťování obsahu mikroorganismů v prostředí budov apod., kde dominují spory bakterií a mikroskopických hub, a proto jsou v této metodě používány selektivní média, aby se zachytila co nejširší diverzita. Pro izolaci sinic a řas je nutné modifikovat metodu, a to především v přidáním vyšší koncentrace antimykotik. Také je nutné počítat, že sinice a řasy nejsou ve vzduchu zastoupeny v nějak výrazné míře a tomu je nutné upravit metodiku (doba expozice, průměr misek apod.). Efektivnější metodou je využití tzv. aeroskopu (Obr. 4.5.), což je prakticky vysavač, který nasává vzduch z prostředí a umožňuje pak následnou kultivaci zachycených mikroorganismů ať už na misce nebo v kultivačním médiu. Podobně jako v případě spadové metody je důležité při kultivaci takto získaných vzorků přidávat do médií antimykotika.

Obr. 4.5. Aeroskop SAMPL'AIR™ (z https://www.akribis.co.uk/)

Zvláštní kapitolou je izolace pikoplanktonních fototrofních organismů, tj. sinic a řas, jejich velikost se pohybuje v rozmezí 0,2–2 µm. Izolace těchto organismů je náročná především proto, že v ní hraje důležitou roli čistota a sterilita izolačních pomůcek a kultivačních médií a také kultivační podmínky, na izolaci jsou poměrně náročné mořské pikoplanktonní sinice. Z klasických metod lze využít:

  1. filtrace přes sterilní filtry, kdy na filtru zůstávají zachyceny větší organismy a pikoplanktonní organismy filtrem projdou;

  2. sedimentační nebo centrifugační metoda, kdy pikoplanktonní organismy zůstávají ve vodním sloupci;

  3. ředící technika;

  4. izolace kapilárou s využitím metody zalití do agaru.

Většina z uvedených metod je opět spíše přípravou na následné izolování. Moderní metoda, která se zdá být pro planktonní pikoorganismy efektivní, je průtoková cytometrie s tříděním buněk (viz. Kapitola 5.2.).