ALGOLOGICKÉ KULTIVAČNÍ TECHNIKY

Mrazové uchovávání sinic a řas

Metoda mrazového uchovávání metabolicky neaktivních kultur sinic a řas je poměrně rozšířená v různých sbírkách mikroorganismů a je brána především jako záložní metoda ke klasickému udržování živých kultur přeočkováváním (serial transfer).

Obr. 8.1. Zastoupení různých přístupů v udržování kultur ve sbírkách (Lorenz et al., 2013).

V současné době jsou kultury sinic a řas udržovány v inaktivním stavu v nádobách s tekutým dusíkem, případně v hlubokomrazících boxech (deep freezers). V mikrobiologii používaná metoda lyofilizace, založená na sublimaci zmrzlé vody při nízkém tlaku a teplotě (tzv. mrazové sušení), která se využívá například v mikrobiologii pro některé bakterie, se pro sinice a řasy příliš nehodí.

Kryoprezervace má několik zásadních výhod a to především to, že v uloženém materiálu neprobíhají genetické změny (selektivní tlak a/nebo genetický drift), nehrozí kontaminace materiálu, zařízení pro mrazení a skladování je méně náročné na prostor než klasické udržování živých kultur, provoz je méně finančně náročný. Nevýhodou jsou většinou vysoké vstupní náklady, nutné pravidelné dodávání tekutého dusíku a časové omezení práce s kulturami, které většinou vyžadují 2 až 3 týdny na regeneraci ze zmrazeného materiálu.

Fyzikální a biologické pozadí kryoprezervace

Během mrazení není zmrazení vzorku uniformní, protože voda obsahuje různé rozpuštěné částice, stejně tak je poměrně důležitým faktorem heterogenita mražených buněk (obsah vody, velikost, morfologie apod.). Během mrazení se tvoří krystaly nejdříve z čisté vody a dochází k zahušťování látek v ní rozpuštěných. Díky plynulému snižování teploty dochází k vyrovnanému stavu ledu a tekuté vody, tato rovnováha se pak postupně posouvá díky plynulému snižování teploty. Přestože teplota tání ledu je 0 °C, může být při dobře kontrolovaných podmínkách docíleno toho, že voda může být zchlazena přibližně k -40 °C, než dojde k nukleci ledu (Day, 2004).

Pro úspěšnou kryoprezervaci je zásadním faktorem tvorba intracelulárního ledu, který může buňku poškodit - tento problém se většinou eliminuje přidáním kryoprotektantů, rychlostí snižování teploty apod. Roli v úspěšnosti kryoprezervace a následného rozmrazení hraje také rychlost mrazení, která se obvykle pohybuje v rozmezí -0,1 °C.min-1 až -10 °C.min-1, nejčastěji je rychlost mrazení -1 °C.min-1.

Během mrazení mohou být buňky různými způsoby poškozeny, například mechanickým stresem, formací intracelulárního ledu, osmotickým stresem apod.), přehled možných poškození uvádí následující tabulka (Tab. 8.1.)

Stresový faktor

Snížení teploty

Zvýšení koncentrace rozpuštěných látek

Zvýšení koncentrace iontů

Dehydratace

Tvorba bublinek plynu

Zvýšení viskozity roztoku

Změny pH

Nahloučení buněk

Možná odpověď buňky

změny v lipidech membrány

depolymerizace cytoskeletu
osmotické smrštění

dopad na strukturu membrán

destabilizace dvojité lipidové membrány

poškození membrán a cytoskeletu

dopad na difúzi, možná osmotická limitace

denaturace bílkovin apod.

poškození membrán

K eliminaci rizika poškození buněk během vlastního procesu kryoprezervace se využívají kryoprotektanty, což jsou ve vodě rozpustné látky, které jsou přidávány do suspenze buněk před mražením. V přírodě jsou nejčastějšími kryoprotektanty cukry a cukerné alkoholy. Tyto látky snižují teplotu homogenní nukleace ledu, zvyšují rekrystalizační teplotu a ovlivňují (snižují) množství volné vody v systému, což vede k omezení tvorby intracelulárního ledu a současně ovlivňuje osmotické změny. V rámci kryoprezervace sinic a řas se nejčastěji používají jako kryoprotektanty methanol nebo dimethylsulfid.

Pro úspěšné zmrazení a následné rozmrazení jsou také zásadní biologické faktory, především (1) stáří kultury, nejlépe je zmrazit buňky v pozdní exponenciální fázi, (2) intenzita osvětlení , (3) teplota, (4) osmotický potenciál média, (5) limitace živinami, (6) typ výživy (Day, 2004).

Metody kryoprezervace

Sinice a řasy je možné zmrazit několika způsoby: (1) pasivní mražení, (2) kontrolované mražení, (3) metoda enkapsulace. Obecné protokoly pro kryoprezervaci sinic a řas byly publikovány například Day (2007) nebo Day & Harding (2008), návody na přípravu materiálu pro kryoprezervaci jsou uvedeny v Kapitole 14.7.

Obr. 8.1. Zařízení pro pasivní mrazení Mr. Frosty (Nalgene).

Obr. 8.2. Zařízení pro pasivní mrazení CoolCell (Corning BV).

Při pasivním mražení je rychlost mrazení ovlivněná vlastností kapaliny, která je součástí zařízení pro mražení, dříve se využíval ethanol, dnes se používá isopropylalkohol. Dnes se pro pasivní mrazení používají komerně dodávaná zařízení - Mr. Frosty (Obr. 8.1.), Handi-Freeze nebo CoolCell (Obr. 8.2). Tyto metody fungují na stejném principu mrazení postupným snižováním teploty rychlostí -1 °C.min-1 po umístění zařízení se vzorky do hlubokomrazícího boxu s teplotou -80 °C. Jedná se o tzv. dvoukrokové mrazení, kdy se v druhém kroku vialky ze zařízení vyndají (při teplotách mezi -30 °C a -80 °C) a dají rovnou do nádoby s tekutým dusíkem (cca. -150 °C), kde jsou skladovány. V případě zařízení Mr. Frosty se k mrazení používá isopropylalkohol nalitý do nádobky, u CoolCell je mrazení dáno technologií nádoby.

Při řízeném mrazení se využívají zařízení označovaná jako planery (Obr. 8.3.), jedná se o zařízení, ve kterých lze řídit a programovat celý mrazící proces. Využití těchto zařízení má hlavní výhodu, že se mohou mrazící programy přizpůsobovat jednotlivým kulturám, v některých případech mohou být využívány i pro ekofyziologické experimenty. Běžný protokol pro řízené mrazení se skládá z (1) vychlazení komory z pokojové teploty na -40 °C, rychlost chlazení je -1 °C.min-1, (2) udržování teploty -40 °C do dobu 30 minut a (3) přenesení zmrazených kultur do tekutého dusíku.

Obr. 8.3. Zařízení pro řízené zmrazování planer Kryo 560 (z https://planer.com/products/cryo-freezers/medium-crf/kryo-560.html)


Alternativní metodou mrazení je enkapsulace, kdy jsou mražené řasy imobilizovány v kuličkách z alginátu (sodná sůl kyseliny alginové), následně jsou osmoticky dehydratovány (25 hodin v 0,1 M až 1 M roztoku sacharózy), vysušeny na obsah vody zhruba 20 - 30 °C a přeneseny přímo do tekutého dusíku, detailněji v kapitole 14.7.

Rozmrazování, viabilita

Rozmrazování kultur je pak realizováno jednoduchým vytažením zmrazených kultur a jejich rozmrazení ve vodě o teplotě 40 °C, do okamžiku, kdy se rozpustí poslední zbytky ledu, pak se kultury rozoočkují buď do malého objemu tekutého média, nebo na agarovou plotnu.

Tab. 8.2. Diverzita kultur udržovaných v kryoprezervaci (Day & Brand, 2005).

Skupina

Skupina

Chlorarachniophyta

Chlorophyta

Cryptophyta

Cyanobacteria

Dinophyta

Euglenophyta

Glaucophyta

Haptophyta

Heterokontophyta

Rhodophyta

Sbírka CCAP

Počet kmenů

0

700

20

180

3

40

1

0

80

10

% úspěšně kryoprez.

0

68

0

80

0

70

0

0

69

10

Sbírka UTEX

Počet kmenů

2

1,358

13

191

26

71

2

19

153

117

% úspěšně kryoprez.

50

70

8

97

12

68

0

16

58

56

Pro udržování kultur v tekutém dusíku je zásadní, aby byl materiál po svém rozmrazení co nejvíce viabilní, tedy životaschopný. Přestože se může zdát že metoda kryoprezervace je poměrně univerzální, nelze ji aplikovat na všechny skupiny řas. Viabilita je napříč skupinami poměrně variabilní (viz Tab. 8.2.), přičemž sinice jsou obecně odolnější než řasy a z řas jsou nejodolnější půdní řasy, které jsou dobře adaptovány na stresové prostředí. Proto je třeba v případě mrazení kultur provádět testy viability a pro dlouhodobé uchovávání v tekutém dusíku vybrat jen takové kultury, jejichž viabilita po rozmrazení je vyšší než 60%.

Metoda kryoprezervace má však obrovský potenciál pro dlouhodobé udržování materiálu, jak ukazuje Tab. 8.3., ve které jsou uvedeny viability vybraných kmenů rozmrazovaných po různě dlouhých intervalech. Nejvýhodnější je kombinace kryoprezervace a klasického přeočkovávání.

Tab. 8.3. Působení dlouhodobého skladování v tekutém dusíku (Day, 2004). Kultury, u kterých nebyla stanovena viabilita jsou označeny +, data na základě minimálně tří opakování.

Kmen řasy (skupina)

Doba skladování (roky)

Viabilita (%)

Chlorella emersonni (Chlorophyta)


Chlorella protothecoides (Chlorophyta)


Scenedesmus acutus (Chlorophyta)


Scenedesmus basiliensis (Chlorophyta)


Pediastrum duplex (Chlorophyta)


Tetraselmis suecica (Chlorophyta)


Euglena gracilis (Euglenophyta)


Heterococcus protonematoides (Xanthophyceae)

0
70,2

0
85,0

0
73,0

0
92,8

0
90,0

0
73,2

0
36,6

0
26,0

8
+

1
+

1
78,6

1
92,4

1
89,6

1
70,6

1
+

8
+

11
+

8
+

4
78,0

11
+

4
102,0

5
72,3

10
+

15
34,4

13
72,5

14
+

6
70,2

18
+

6
94,5


18
+




17
+

10
75,6

20
90,6

10
96,5






22
84,2