ALGOLOGICKÉ KULTIVAČNÍ TECHNIKY

Moderní - automatizované - metody izolace mikrořas

Kromě tradičních metod se začínají uplatňovat moderní metody izolace sinic a řas, v běžné laboratoři zastoupené především využíváním mikromanipulátorů a v poslední době se dostávají do povědomí automatické metody, které lze využít také při izolaci organismů do kultur, příkladem takových metod jsou průtoková cytometrie a její modifikace, optická pinzeta a poměrně nový obor mikrofluidika.

Mikromanipulátor

Využívání mikromanipulátorů je paralelou k izolaci pomocí skleněné kapiláry (viz Kapitola 4.2.). Mikromanipulace je zjednodušeně “pouze” převedení hrubého pohybu lidské ruky do jemných miniaturních pohybů přístroje – mikromanipulátoru. Mikromanipulátory mají široké využití v mikrobiologii, ale také při práci s tkáňovými kulturami a v lékařství především v oblasti asistované reprodukce. Mikromanipulátorem lze buňky nasávat do skleněných kapilár, případně buňky injektovat.

Podle toho, jakého mechanismu se využívá při převodu pohybu ruky na pohyb přístroje, rozdělujeme mikromanipulátory na (1) mechanické, (2) hydraulické, (3) elektrické a (4) piezoelektrické. V rutinní mikrobiologické praxi se nejčastěji setkáváme s mechanickými a hydraulickými typy mikromanipulátorů.

Obr. 5.1. Mechanický mikromanipulátor ovládaný joystickem (NARISHIGE Group)

Obr. 5.2. Hydraulický mikromanipulátor s joystickem pro pohyb ve třech osách (NARISHIGE Group)

Nejjednodušší mechanické mikromanipulátory (Obr. 5.1.) s přímým pohonem využívají pohybu ozubených kol. Přenos pohybu ruky na pohyb jehly uchycené v přístroji je v přístroji okamžitý, avšak díky konstrukci přístroje může docházet k vibracím. Hydraulické mikromanipulátory (Obr. 5.2. a 5.3.) využívají k přenosu pohybu ruky na pohyb přístroje pohyb hydraulické kapaliny, založené na proudění kapaliny řízené písty různých průměrů spojené trubičkou obsahující nestlačitelnou tekutinu, tento typ mikromanipulátorů patří k nejčastěji využívaným v běžné laboratorní praxi.

U moderních elektrických mikromanipulátorů (Obr. 5.2.) je pohyb řízený velice přesnými motory, oproti mechanickým mikromanipulátorům nereagují hydraulické a elektrické mikromanipulátory přímo a díky tomu jsou redukovány případné vibrace. Zvláštním typem mikromanipulátorů jsou piezoelektrické mikromanipulátory, jejichž využití je především v oblasti umělé reprodukce – tyto mikromanipulátory využívají k pohybu piezoelektrické krystaly, které mají schopnost generovat elektrické napětí při svém deformování, a díky nesouvislosti vzniklého pohybu dobře penetrují buněčné membrány.

Obr. 5.3. Obr. 5.3. Sestava invertovaného mikroskopu a dvou hydraulických mikromanipulátorů (NARISHIGE Group)

Obr. 5.4. Mikromanipulátor s pohybem řízeným motorem (NARISHIGE Group)

Při izolaci sinic a řas přináší využití mikromanipulátoru výhodu jemných a přesných pohybů ve srovnání s využitím klasické mikrokapiláry. Mikromanipulátoru lze využít tedy využít při izolacích anebo při přečišťování kultur kontaminovaných kultur. Další výhodou je možnost koupě připravených sterilních kapilár různých průměrů. Z negativ je převažující poměrně velká pořizovací cena i v základních modelech a nutnost používání invertovaného mikroskopu a časová náročnost ve srovnání s využitím mikrokapiláry. Další nevýhodou je, že izolace pomocí mikromanipulátoru není univerzální metodou – mikromanipulátory se nehodí pro izolaci pohyblivých bičíkatých řas, které většinou utečou, než kapilára přístroje sjede do kapky média, v případě některých vláknitých a ve slizu uložených buněk dochází často k ucpávání kapilár. Úspěšně ho však lze využít pro většinu kokálních typů sinic a řas.

Průtoková cytometrie (flow cytometry)

Průtoková cytometrie patří mezi metody luminiscenční analýzy, přesněji se jedná o fluorescenčně optickou metodu, kdy je vzorek unášen proudem nosné kapaliny (fluid sheat). Každý průtokový cytometr sestává z několika základních součástí, a to excitačního zdroje, měřící optické cely, forward scatter detektoru, side scatter detektoru, systému zrcadel, optických filtrů a několika fluorescenčních detektorů seřazených podle vzrůstající vlnové délky emitované fluorescence (Novák et al., 2008). Základními částmi průtokového cytometru jsou tedy fluidika, optika a elektronika. Celkový rozsah jejích aplikací je široký a zahrnuje například stanovení obsahu jaderné DNA, určení ploidie, analýzu buněčného cyklu, studium genové exprese, počítání a určení typu krevních buněk, detekci a charakterizaci mikroorganismů, třídění požadovaných částic a jiné (Suda, 2005).

Pro analýzu je třeba, aby se měřené buňky nacházely ve formě suspenze – důvodem je nutnost, aby buňky procházely postupně za sebou za konstantní rychlosti. Fluidní složku cytometru tvoří nosná kapalina (fluid sheat), která zajišťuje transport buněk. Suspenze buněk je uložena ve zkumavce, ze které vybíhá kapilára, tato kapilára je obtékána nosnou kapalinou, které z této kapiláry strhává buňky. To, aby měřícím bodem prošla pouze jedna buňka, zajišťuje hydrodynamická fokusace – vzorek je vstřikován tak, aby nedošlo k jeho mísení s nosnou kapalinou, ale aby byl současně vytvořen koaxiální proud, což zajišťuje v kombinaci se zúžením kapiláry průchod právě jedné částice. Optická část je pak tvořena excitační optikou a sběrnými optickými cestami. Součástí excitační optiky je silný zdroj světla, nejčastěji se jedná o různé typy laserů, případně rtuťové lampy, tyto světelné zdroje emitují monochromatické záření, kterým je buňka ozářena v měřící cele. Sběrnou optiku pak tvoří soustava čoček, zrcadel a filtrů (Roubalová, 2012).

Obr. 5.5. Schéma průtokového cytometru (zdroj Wikipedia, upraveno).

Při průchodu buňky paprskem laseru dojde k rozptylu světla, tento rozptyl souvisí například s indexem odrazivosti, velikostí a tvarem částice. Světlo se pak rozptýlí, odrazí nebo při určité vlnové délce vyvolá fluorescenci. Úhel rozptylu světla ve směru toku paprsku detekuje forward scatter detector (detektor pro přímý rozptyl FSC), odezva toho filtru souvisí s velikostí buněk, současně je také možné odlišení živých a mrtvých buněk. Druhým typem detektoru je side scatter detector (detektor pro boční rozptyl, SSC), který detekuje světlo odražené pod úhlem 90° vzhledem ke směru toku excitačního paprsku, signál tohoto detektoru odpovídá granularitě buněk (Novák et al., 2008). Posledním typem signálu je fluorescence, kdy po excitaci zářením o určité vlnové délce dochází k uvolnění energie ve formě fotonů s jinou delší vlnovou délkou, látky schopné fluorescence se nazývají fluorochromy (Roubalová, 2012). Příklady nejběžnějších fluorochromů v průtokové cytometrii jsou uvedeny v Tab. 5.1. Fluorescenční barviva se dělí na vlastní, která jsou součástí buněk a nevlastní, která jsou přidána ke vzorkům, které nemají vhodné fluorescenční vlastnosti (Novák et al., 2008). U fluorochromů je vhodné, aby se jejich absorpční maximum co nejvíce blížilo vlnovým délkám běžně používaných laserů.

Zkratka

FITC

APC

PE

PerCP

Název

Fluorescein isothiocyanate

Allophycocyanin

Phycoerythrin

Peridinin-chlorophyll-protein complex

Excitační vlnová délka [nm]

488

630

488

488

Emisní vlnová délka [nm]

530

661

580

675

Výsledky analýzy s využitím průtokové cytometrie jsou zobrazeny ve formě histogramů bodů (dot plot diagrams). Tyto histogramy představují rozložení odpovídajících bodů dvou zvolených parametrů v dvourozměrném prostoru. Běžné průtokové cytometry jsou schopny zachytit 6 až 12 parametrů proměřované buňky, jedná se především o (1) relativní distribuce částic ve formě histogramu (měřeno forward scatter detector); (2) relativní distribuce granularity části ve formě histogramu (měřeno side scatter detector), (3) relativní distribuce fluorescence různých vlnových délek (Novák et al., 2008).

Průtokové cytometrie bylo využito při studiu vzorku subtropického mořského pikoplanktonu z oblasti Pacifiku (Obr. 5.6.), kdy byly populace ve společenstvu charakterizovány jejich velikostí a fluorescencí jejich pigmentů. Ve vzorku jsou zastoupeny tři populace pikoplanktonních fototrofů – drobný rod Prochlorococcus (0,6 µm v průměru) charakterizovaný pouze fluorescencí chlorofylu, druhou populaci tvořil rod Synechoccocus (velikost zhruba 1 µm) charakterizovaný fluorescencí fykoerytrinu a poslední populace je zastoupena pikoeukaryoty, který emitují červenou fluorescenci (Vaulot et al., 2004).

Obr. 5.6. Příklad výsledků s využitím průtokové cytometrie – analýza přírodního vzorku z oblasti rovníkového Pacifiku (Vaulot et al., 2004).

Některé cytometry jsou vybaveny třídiči (sorters), zařízeními schopnými třídit procházející částice na základě zvolených charakteristik:

  • elektrostatický kapénkový sorter (electrostatic droplet sorter) – k vychýlení částic (např. buněk řas) dochází s využitím elektrostatické síly;

  • fluidní switch sorter (fluidic switch sorter) – k vychýlení částic z hlavního proudu kapaliny dochází s využitím piezoelektrického ventilu.

Obr. 5.7. Schéma průtokové cytometrie s Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS) pomocí elektrostatického kapénkového sorteru (zdroj Wikipedia, upraveno).

Jednotlivé buňky lze třídit podle jedné nebo více charakteristik, při třídění dochází k přeměně tekutého proudu kapaliny unášející vzorek na aerosol, jehož kapénky obsahují jednotlivé buňky – po ozáření kapének laserem dochází k lomu světla na kapénkách (viz text o detekci výše) a systém rozhodne o druhu částice, a následně provede separaci buněk (Novák et al., 2008). Častá je metoda tzv. fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (Fluorescence Assisted Cell Sorting, FACS), kde je třídění založené na základě specifického rozptylu světla a fluorescenčních vlastností jednotlivých buněk (Obr. 5.7.). Tohoto přístupu se může využít při izolaci řas ze směsných vzorků, na základě jejich specifických pigmentů (např. skrytěnky nebo obrněnky).

Průtoková cytometrie má mnoho výhod – velké množství analyzovaného materiálu, rychlost analýzy, možnost kvantitativní i kvalitativní analýzy, třídění buněk apod. Hlavní nevýhodou je vysoká finanční náročnost a nutnost zkušeností pro přípravu, analýzu a vyhodnocení experimentů.

Optická pinzeta

Optická pinzeta představuje důležitý nástroj pro manipulaci s jednotlivými buňkami, optických pinzet se využívá nejčastěji v medicínské výzkumu, in vitro oplodnění, buněčné interakce, embryologie apod. Jedná se o nekontaktní manipulační techniku (Ulanowski, 2001, Zhang & Liu, 2008). Zjednodušeně lze říci, že optickou pinzetu lze vytvořit soustředěním laserového paprsku do malého bodu s využitím imerzního objektivu (Ulanowski, 2001).

Obr. 5.8. Schématické znázornění optické pinzety (zdroj https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10774)

Optických pinzet lze využít při třídění buněk, např. jednoduchou videodetekcí cílové buňky a její odklon s využitím vícepaprskové optické pinzety, prostřednictvím takzvané aktivní mikromanipulace (Song et al., 2008). Využití optické pinzety ve spojení s řasami by mohlo představovat primárně možnost mikromanipulace, které může být využito například pro sekvenování jednotlivých buněk špatně kultivovatelných organismů nebo zájmových druhů, které jsou ve vzorku řídce zastoupeny. Současně mohou být optické pinzety využity při fyziologických studiích sinic a řas, např. Pilát et al. (2013) využili optických pinzet při studiu vlivu světla na mikroskopickou řasu Trachydiscus minutus s cílem zjistit míru poškození buněk světlem různých vlnových délek.

Mikrofluidika

Mikrofluidika je moderní rozvíjející se obor, který umožňuje manipulovat s velmi malými objemy roztoků v mikrokanálcích o rozměrech mikrometrů. Jedná se o multidisciplinární obor, který kombinuje inženýrství, fyziku, chemii, biochemii, nanotechnologii a biotechnologii. Pro mikrofluidní systém je typický transport, míchání nebo separace (třídění) kapalin (viz. Obr. 5.9). Velkou výhodou komerčních mikrofluidních systémů je jejich miniaturizace do podoby čipů a kitů (tzv. cartridge) použitelných pro různé typy analýz (Obr. 5.10).

Obr. 5.9. Schéma separačního kříže, výřez rozhraní dávkovacího a separačního kanálku (Smejkal & Foret, 2012). A – dávkování vzorku; B – separace vzorku.

Obr. 5.10. 2100 Bioanalyzer s čipy a kity pro čtyři typy analýz – DNA, RNA, proteinů a cytometrii (Smejkal & Foret, 2012).

Mikrofluidních systémů lze využít při tzv. micro-flow cytometrii, fungující na stejných principech jako klasická průtoková cytometrie, ale v mikroskopickém prostředí. Třídění funguje také na stejném principu – analýza procházející buňky, vyhodnocení signálu a příslušné vytřídění dané buňky.

Mikrofluidního systému v podobě čipu (lab-on-chip) využili například Song et al. (2012) při studii zabývají se eliminací řas z balastní vody z velkých transportních lodí. Čipu bylo v této práci použito k sledování vlivu ošetření balastní vody na pokles množství řas v této vodě, prostřednictvím čipu byly určeny počty buněk a současně byly tyto buňky tříděny podle velikostí.

Obr. 5.11. Schéma mikrofluidního třídícího kříže a sorteru (Wang et al., 2005).

Obr. 5.12. Schéma sorteru buněk s mikrofluidní cartridge (Wang et al., 2005).



Využití mikrofluidního systému pro třídění buněk využil například Wang et al. (2005), který využil fluorescenčně aktivovaný mikrofluidní buněční sortes k analýze savčích buněk s využitím GFP (green fluorescent protein) jako fluorescenčního signálu. Právě fluorescenčně aktivovaného třídění buněk by mohlo být do budoucna využito ve spojení s řasami se specifickými barvivy, ať už při jejich izolaci nebo purifikaci (Obr. 5.11 a 5.12.).