ALGOLOGICKÉ KULTIVAČNÍ TECHNIKY

Metody purifikace kmenů

V některých případech může u vyizolovaných nebo udržovaných kultur sinic a řas dojít jejich kontaminaci, tato kontaminace může být způsobená různými faktory, například nedostatečným přečištěním izolovaného materiálu během iniciálních izolací, nedodržováním sterilní práce nebo může dojít ke kontaminaci, způsobené nedostatečně sterilním prostředím (např. špatně fungující autokláv nebo laminární box).

Nejčastěji dochází ke kontaminaci kultur různými druhy bakterií, kvasinek, vláknitých mikroskopických hub, prvoků a také různých typů virů. V některých případech může dojít ke kontaminaci kultur roztoči anebo vzájemné kontaminaci kultur. Každý z těchto kontaminantů je různým způsobem odolný vůči chemických biocidním látkám (viz. Obr. 9.1.).

Pokud dojde ke kontaminaci kultury, je nutné tuto kulturu vyřadit a oddělit od ostatních a co nejrychleji ji purifikovat vhodným způsobem.

Kultury je po jejich přečištění potřeba zkontrolovat, aby bylo jisté, že byla kontaminace odstraněna. Kontrola může být provedena pod běžným optickým mikroskopem nebo lépe pod fluorescenčním mikroskopem, případně lze využít modernějších metod, jako je průtoková cytrometrie, a v případě virových infekcí transmisní elektronová mikroskopie. V rutinní laboratorní praxi lze účinnost purifikace kontrolovat kultivací na selektivních agarových plotnách (*14) kultivovaných při podmínkách vhodných pro heterotrofy a následná vizuální kontrola, stejně tak lze využít tuto kultivační metodu pro průběžné kontrolování čistoty udržovaných kultur.

Obr. 9.1. Pokles míry rezistence mikroorganismů vůči chemickým biocidům (podle Tortora et al., 2013).

Kontaminace kultur bakteriemi a mikroskopickými houbami

Kontaminace kultur bakteriemi (Bacteria) se nejčastěji projevuje ve formě zákalu kultur v kultivačních médiích nebo slizových kolonií různých typů na zkumavkách a miskách s agarovými plotnami, kolonie jsou nejčastěji bezbarvé, případně mohou být různě zbarveny, nejčastěji odstíny žluté, oranžové, červené apod. Podobné je to v případě kontaminací kvasinkami (netaxonomická skupina zahrnující zástupce patřící mezi Ascomycota a Basidiomycota). Z kontaminací houbovými organismy je však častější kontaminace vláknitými mikroskopickými houbami – plísněmi (nejčastěji ze skupiny Ascomycota), které se projevují jako typické kolonie na agarových plotnách nebo jako vločkovité a vláknité útvary v tekutých kulturách, nejčastěji bíle zbarvené. Zvláštním typem houbové infekce je napadení kultur parazitickými houbami (nejčastěji ze skupiny Chytridiomycota a Oomycota, ale jejich diverzita je mnohem větší), kdy se napadení těmito organismy projeví nejprve změnou barvy buňky, obvykle do hnědého odstínu, protože je porušena syntéza chlorofylu, parazit postupně stráví protoplast hostitelské buňky až na červenohnědé zbytky karotenoidů, přítomnost prázdných buněk s červenými zrny uvnitř obvykle včas signalizuje napadení populace parazitem, dále se na buňce vyvíjejí sporangia nejrůznějších tvarů, spóry apod. (Lukavský, 2003a).

K purifikaci kontaminovaných kultur, lze využít několika přístupů – mechanické odstranění kultivace, eliminace kontaminace některým z fyzikálních faktorů a aplikace biocidních prostředků (různých chemikálií, antibiotik nebo antimykotik).

Obecně lze k purifikaci kultur využít klasických metod, jako je ředící technika (Kapitola 4.4.), roztěr na agarových plotnách (Kapitola 4.3.) nebo využití mikrokapiláry (Kapitola 4.2.) nebo mikromanipulátoru (Kapitola 5.1). Volba metody záleží také na míře kontaminace kultury, při výrazně kontaminované kultuře je vhodné zvolit jiný přístup, nejčastěji aplikaci antibiotik nebo antimykotik.

V některých případech se osvědčilo vystavení kontaminovaných kultur podmínkám, které způsobují stres heterotrofním organismům – především vyšší ozářenost nebo teploty – a vlastní sinici nebo řasu nelimitují. U kultur s mírnou kontaminací mikroskopickými houbami se osvědčilo dlouhodobé udržování za pravidelného míchání na laboratorní třepačce.

Při kontaminaci bakteriemi a kvasinkami lze využít purifikace filtrací, kdy je kontaminovaná kultura přefiltrována přes membránový filtr (Kapitola 2.1.2) a několikrát promyta sterilním médiem. Kontaminace projdou přes póry filtru a na filtru zůstane přečištěná biomasa. Během promování by se nemělo stát, že by kultura na filtru vyschla, to by vedlo k fyziologickému stresu (Guillard, 2005).

Mechanicky lze některé kontaminace odstranit také s využitím centrifugace, která je dobře použitelná pro řasy, které tvoří homogenní kulturu. Ve sbírce CCALA se poměrně dobře osvědčila metoda s využitím aplikace povrchově aktivní látky Tween80 – kultura je přenesena do zkumavky se sterilním médiem s 5 % (v/v) Tween80 (*15), obsah zkumavky je intenzivně protřepán nebo promíchám s využitím vortexu (*16) a stočen na centrifuze (3000 otáček, po dobu 30 minut), supernatant je slity a kultura je promyta stejným způsobem promyta v novém médiu s Tween80, tento postup se opakuje alespoň třikrát, následně je podobným způsobem kultura promyta ve sterilním médiu bez přídavku Tweenu, aby došlo k odstranění zbytků Tweenu, následně je kultura přeočkována na agarovou plotnu nebo do tekutého média. V případě, že kultura tvoří kompaktnější kolonie, je potřeba tyto kolonie rozrušit, aby bylo přečištění centrifugací efektivní. Nejčastěji se k tomu využívá působení ultrazvuku, rozdrcení kolonií mezi sterilními krycími sklíčky nebo homogenizérem.

V případě využití různých antimikrobiálně působících látek se může jednat o jednoduché anorganické sloučeniny, např. teluričitan draselný (K2TeO3) o koncentraci 10 mg.l-1, který je toxický pro bakterie, nebo oxid germaničitý (GeO2) v koncentracích 1 - 10 mg.l-1, který eliminuje rozsivky a některé řasy (Guillard, 2005). V případě mikroskopických hub se nejčastěji používá antimykotikum cycloheximid v různých koncentracích, případně nystatin, obě látky je vhodné sterilizovat filtrací, autoklávování jejich efekt snižuje, v případě kultur v tekutých médiích se osvědčilo použití kofeinu (v koncentracích 0,01 - 0,03 M). V případě aplikace antibiotik lze použít jednotlivá antibiotika, případně kombinace uvedené v různých typech publikací anebo komerčně dodávané premixy antibiotik (např. Sigma Aldrich dodává “Antibiotic Antimycotic Solution” obsahující streptomycin, amphotericin a penicilin). Přehled běžně užívaných antibiotik a antimykotik je uveden v Kapitole 14.9.

Kontaminace kultur prvoky a roztoči, vzájemné kontaminace kultur

Mezi prvoky, kteří mohou kontaminovat kultury, patří především různé druhy měňavek (skupina Amoebozoa) a nálevníci (Ciliophora, Ciliata) nebo různí drobní heterotrofní bičíkovci. V případě kontaminace těmito organismy přichází v úvahu buď mechanické přečištění kultur (např. pasážováním na agaru, izolací mikrokapilárou nebo mikromanipulátorem), nebo využití antibiotik (např. použití metronidazolu v případě kontaminace měňavkami). Kontaminace prvoky nejsou běžným problémem při udržování kultur a vzhledem k jejich diverzitě se těžko hledá univerzální řešení v případě kontaminací.

Kultury mohou být kontaminovány také roztoči (Acari, Obr. 9.2.), riziko kontaminace je především spojováno s nedostatečností čistoty kultivačních místností (např. nečištěné filtry klimatizačních jednotek) a také s izolacemi z přírodního materiálu, kdy například misky s výraznou dominancí zelených řas nebo porostlé vláknitými houbami, bývají prvními, které jsou napadeny roztoči. Jako prevence se doporučuje využívat lékařského benzínu, kterým jsou buď ošetřovány povrchy nebo je nakapán na vatové zátky. V případě kontaminace kultur roztoči, je důležité zavčas kultury oddělit od ostatních kultur a v ideálním případě neprodleně likvidovat. Pokud je nutné s kulturou dále pracovat, je v některých případech vhodné aplikace veterinárního přípravku Arpalit Neo, který by měl zahubit roztoče, následně je možné pokusit se izolovat z čistých míst do nových kultur. Nadále je však vhodné tyto nové kultury udržovat mimo ostatní kultury a pravidelně je kontrolovat – velkým rizikem je přehlédnutí špatně pozorovatelných vajíček roztočů. V případě kontaminace kultivačních prostor (regály, boxy apod.) je vhodné aplikovat některé z veterinárních přípravků, např. insekticidní postřikový přípravek na hubení hmyzu s dlouhodobým účinkem Bio Kill.

Obr. 9.2. Roztoči v kultuře (foto M. Bohunická)

V případě vzájemných kontaminací kultur, často drobnými kokálními sinicemi nebo řasami, se nejčastěji používají mechanické způsoby odstranění kontaminantů z kultury.

Virové infekce kultur

Coy et al. (2018) uvádějí existenci 65 virů eukaryotických řas, které jsou známé z laboratorních kultur, množství virů napadající řasy je ve skutečnosti mnohem větší a je postupně poznáváno s rozvojem moderních molekulárních metod. Známé jsou například velké DNA viry ze skupiny Phycodnaviridae, které napadají například chaluhy nebo zástupce rodu Chlorella (Van Etten et al., 2002). Mnohé z těchto virů jsou druhově specifické a hrají často důležité ekologické role. Stejně tak existují skupiny virů, které napadají sinice, nejčastěji se jedná o cyanofágy z několika skupin (Myoviridae, Siphoviridae a Podoviridae), mnohé jsou opět hostitelsky specifické (Safferman et al., 1983).

V případě kultur sinic a řas je velmi těžké tyto infekce detekovat s předstihem. Existují tzv. chronické virové infekce, které se těžko detekují, protože množství buněk odumřelých z důvodu virové infekce je v rovnováze s novými buňkami, tento typ virové infekce zatím nebyl u řas prokazatelně pozorován, spekuluje se o tomto typu infekce ve spojením se zelenou řasou rodu Brachiomonas. Lytické virové infekce se většinou projevují rychlými změnami v morfologii kultur – sedimentace, ztráta pohyblivosti, změna barvy nebo ztráta pigmentů apod. Detekovat virové infekce lze pomocí metod fluorescenčních barviv (např. DAPI, SYBR) a epifluorescence, transmisní elektronové mikroskopie nebo moderních molekulárních metod (Lawrence, 2005).

Vzhledem k současnému stavu poznání těchto virů nejsou zatím vyvinuty postupy pro purifikaci kultur napadených těmito viry. Základem je zde prevence možné kontaminace, spojená především s aseptickou prací a používáním sterilních pomůcek a kultivačních médií. V případě odhalení virové infekce striktní karanténa kontaminovaných kultur.

*14 - Pro bakterie se používá např. masopeptonový agar č. 2, GTK (glukóza, trypton, kvasničný extrakt) nebo LB médium. Pro mikroskopické houby např. agar s kvasničným extraktem, GKCH (glukóza, kvasničný extrakt, chloramfenikol) apod. Recepty na média jsou běžně nalezitelné na internetu nebo je dodává hotová firma Milcom.*15 - Látku lze autoklávovat. Použitá koncentrace se liší podle autorů. *16 - Někteří autoři uvádějí využití ultrazvuku.