ALGOLOGICKÉ KULTIVAČNÍ TECHNIKY

Metody izolace makroskopických řas

Makroskopické mořské řasy, především ze skupiny ruduch (Obr. 9.1.), zelených řas (Obr. 9.2.) a chaluh (Obr. 9.3.), mají poměrně složité životní cykly a obecně jsou náročnější na udržování v kulturách, například nutnost regulace teploty, různé typy osvětlení (mnohdy hraje důležitou roli světelné spektrum) a rozmnožování některých druhů je vázáno na kombinaci světla a teploty.

Většina kapitoly je věnována právě mořským makroskopickým řasám, příklady izolací u některých sladkovodních mezoskopických řas jsou uvedeny v kapitole 4.8. a detailnější informace o kultivaci parožnatek jsou uvedeny v kapitole 6.6. Pěstování mořských makroskopických řas v marikulturách se pak věnuje kapitola 11.4.




Obr. 6.1. Životní cyklus ruduchy Porphyra gardneri (Lee, 2008, upraveno).

Obr. 6.2. Životní cyklus zelené řasy Ulva arasaki (Lee, 2008, upraveno).

Obr. 6.3. Životní cyklus chaluhy Laminaria japonica (Lee, 2008, upraveno).

Sběr v terénu, hrubé kultury (crude cultures)

Sběr v terénu a přeprava vzorků se odvíjí od fyziologických požadavků jednotlivých druhů, obecně platí, že skladovací teplota by měla být od 5 - 10 °C nižší než teplota prostředí (např. chladnomilné druhy v rozmezí 5 - 10 °C, tropické druhy 20 - 25 °C). Většinou odolnější jsou druhy z přílivové oblasti, ty lze sbírat do plastových sáčků, u druhů z hlubší části je nutné počítat s jejich náchylností na změny teploty, a proto je nutné je převážet v nádobách s vodou, aby se předešlo vzniku různých fyziologických stresů. Při sběru drobných druhů je vhodné využívat plastovou pipetu, aby nedocházelo k jejich mechanickému poškození.

Podobně jako u mikroskopických řas, které se před vlastní izolací udržovaly v hrubých nebo obohacených kulturách, je tento postup využitelný i v případě makroskopických mořských řas. Jedná se tedy o předstupeň před další izolací a spočívá v udržování celé řasy nebo její části v laboratorních nebo pololaboratorních podmínkách, nejčastějším důvodem je inicializace tvorby rozmnožovacích buněk, závislé na teplotních a světelných podmínkách anebo regenerace před izolací z vegetativní části stélky. Hrubé kultury je nejlépe udržovat ve sterilní vodě z lokality za příhodných světelných a teplotních podmínek (závislé druhově), před vlastní umístěním do hrubé kultury je potřeba řasu postupně očistit od různých epifytů (Obr. 6.4.), případně přidat do mořské vody oxid germaničitý (GeO2), aby se eliminovalo porůstání rozsivkami.

Obr. 6.4. Postupné očištění ruduchy Gracilaria a dočištění pomocí vatové tyčinky (Redmond et al., 2014).

Izolace z vegetativních částí

Při izolaci vegetativní části se z materiálu z přírody nebo z hrubé kultury odřízne malý kousek stélky, který se následně přečistí, například protažením agarem, a následně se kultivuje v malém objemu média (Obr. 6.5.) ve zkumavkách, mikrodestičkách nebo Petriho miskách. Po zhruba dvou týdnech se kultura zkontroluje a pak následně kultivuje ve větších objemech.

Obr. 6.5. Postup při izolaci vegetativních části stélky a jeho čištění (Redmond et al., 2014).

Zvláštní postup je v případě sifonálních řas (rody Valonia, Bryopsis apod.), které jsou schopné regenerovat z poškozených protoplastů. Izolace spočívá v poškození protoplastů propíchnutím nebo proříznutím a přenesení obsahu do Petriho misek s mořskou vodou, izolace jednotlivých buněk do mikrodestiček, z nichž se pak obnoví nová stélka.

Izolace zoospor pomocí fototaxe

V případě zelených řas a chaluh lze izolovat zooidy (zoospory), které se uvolňují v závislosti na světelných a teplotních podmínkách, k jejich izolaci lze využít klasické metody s mikrokapilárou, případně je možné zoospory zkoncentrovat s využitím jejich fototaxe, kdy je vložen kousek tkáně do média a z jedné strany je osvětlen, následně pak dojde k uvolnění zooidů a jejich zkoncentrování v závislosti na pozitivní nebo negativní fototaxi.

Izolace zygot/aplanospor

Především při izolaci ruduch lze využít nepohyblivých spor - aplanospor - které často přisedají k substrátu. Těchto spor se vytváří během životního cyklu několik druhů (karpospory, tetraspory, monospory apod.) a jsou poměrně velké. Tendence aplanospor ruduch přisedat k povrchu může být využita k jejich izolaci. Ruduchy lze udržovat v hrubé kultuře spolu s krycími a podložními sklíčky, na které přilnou aplanospory, sklíčka jsou pak omyta a z přisedlých spor jsou pěstovány řasy v Petriho miskách.

Izolace z reprodukčních tkání

Při izolaci z reprodukčních tkání (sporangia, gametangia) je potřeba udržovat řasu v kultuře, dokud nezačne produkovat rozmnožovací buňky. Nejčastěji je tento typ izolace realizován v tzv. vlhkých komůrkách, kdy je část stélky odříznutá nebo odstřižená a udržovaná v kapce ve vlhké komůrce umístěné do termostatu, dokud nedojde k uvolnění rozmnožovacích buněk, které většinou přilnout na sklíčko. Následně je kapka odsáta, tkáň je odstraněna a rozmnožovací buňky jsou po promytí sterilní mořskou vodou dále kultivovány v Petriho miskách.

Izolace a kultivace parožnatek

Makroskopické řasy ze skupiny parožnatek (Charophyceae) je možné pěstovat buď přímo z jejich oospor, nebo vegetativně z částí stélky. V případě vegetativního pěstování z přírodního materiálu je nutné ho pečlivě ručně očistit od epifytů a sterilně zasadit do písčito-jílovitého substrátu, autor této metodiky Proctor uvádí, že pokud se epifytické řasy rostoucí na přírodním materiálu dostanou i přes čištění do kultury, nárostové organismy většinou odumřou během kultivace. V případě kultivace parožnatek přímo z jejich oospor je nezbytně nutné povrch oospor sterilizovat, nejčastěji chemickou cestou. Imahori & Iwasa (1965) uvádějí sterilizaci povrchu 1% roztokem chlornanu sodného po dobu 5 minut a následného opakovaného promytí sterilní deionizovanou vodou, jiná metodika publikovaná Wetzel & McGregor (1968) uvádí možnost sterilizace s využitím 70% ethanolu působícího po dobu 2 minut za kontinuálního míchání, autoři však zároveň uvádějí, že viabilita oospor po tomto typu sterilizace není příliš vysoká. Pro oospory s kalcifikovaným povrchem Imahori & Iwasa (1965) doporučují dekalcifikaci pomocí 0,5 M kyselinou octovou před vlastní sterilizací. Další metody uvádějí použití 3% roztoku fenolu, 0,1 % roztoku chloridu rtuťnatého nebo 1 N kyselinu sírovou. Sterilní oospory pak jsou pak vysazeny do již zmiňované kultivační nádoby. Vhodnější pro počáteční kultivaci je zvolit nádoby menšího objemu, Imahori & Iwasa (1965) uvádějí nasazení 20 oospor do 50 ml média. Je nutné zdůraznit, že většina těchto sterilizačních zásahů snižuje procento klíčivosti oospor a proto je nutné pro následnou úspěšnou kultivaci mít dostatek materiálu.

Obr. 6.6. Schématická ilustrace klíčení oospor ve zkumavce a postupný růst parožnatky v kultuře (Imahori & Iwasa, 1965).

McCourt et al. (2017) uvádějí metodiku vytvořenou Procotrem založenou na pěstování ve zhruba 3 litrových nádobách naplněných 3 cm autoklávované nebo propařené zásadité písčito-jílovité půdy, která je zalitá přefiltrovanou nebo párou sterilizovanou vodou (bez přítomnosti chloridů nebo kovů uvolněných z vodovodního řadu, ideálně destilovanou nebo deionizovanou). Uvádějí, že takto získané kultury je možné udržovat více než 20 let. Kultury je možné udržovat pouze na nepřímém slunečním světle na okenním parapetu a jsou tudíž vhodné i pro výukové účely.

Podobný design pro dlouhodobé udržování kultur parožnatek byl vytvořen sbírkou NIES, která v současné době udržuje 27 kultur rodu Nitella, 25 kultur rodu Chara, 2 kultury rodu Nitellopsis a 1 kulturu rodu Lamprothamnium. Pro kultivaci používají podobný design kultivačních nádob, který používají i ostatní autoři, a druhy jsou v závislosti na jejich ekologii kultivovány v různě modifikovaných médiích, lišících se použitým substrátem. Substrát je v nízké vrstvě nasypán do kultivační nádoby a je navlhčen destilovanou nebo deionizovanou vodou, nádoba je uzavřena nebo je hrdlo přetaženo hliníkovou fólií a takto připravená nádoba je autoklávována dva po sobě následující dny. Následně je substrát opatrně, aby nedošlo k jeho rozvíření, zalitý sterilní destilovanou nebo deionizovanou vodou. Sakayama et al. (2004) udržovali kultury rodu Nitella ve dvou typech médií – SWC-1 (substrát tvořen spodní vrstvou listovky a svrchní vrstvou černozemě) a SWC-2 (substrát tvořen říčním pískem s přídavkem uhličitanu vápenatého); další média jsou uvedena na stránkách sbírky NIES. Ve sbírce NIES přidávají do připravených médií 1 až 2 ml roztoku oxidu germaničitého (koncentrace 1 mg.l-1), kultury přesazují do čerstvých médií pomocí špejle nebo pinzety.

Obr. 6.7. Kultura rodu Chara udržovaná ve sbírce NIES (Kawachi & Noël, 2014)

Wuestenberg et al. (2011) modifikoval udržování kultivační nádoby pro kultivaci parožnatek (Obr. 6.8.) a do kultivační nádoby přidal zásobník, ze kterého se do média uvolňuje oxid uhličitý – do trubice z nízkohustotního polyethylenu (Low Density Polyethylene, LDPE), která byla na jednom konci zatavená, byla naplněna hydrogenuhličitanovým pufrem, tvořeným 4 objemovými díly 3 M KHCO3 a 1 objemovým dílem 3 M K2CO3, a zatavena. V uvedeném experimentu byly použity 30 cm dlouhé trubice (průměr 3,2 cm, tloušťka polyethylenu 50 μm) se 40 ml připraveného pufru a byly vyměňovány po 2 – 3 týdnech.

Obr. 6.8. Design kultivačního zařízení pro pěstování parožnatek (Wüstenberg et al., 2011, upraveno).