ALGOLOGICKÉ KULTIVAČNÍ TECHNIKY

Kultivační média

Mořská média

Mořská (slaná) voda obsahuje látky, způsobující její salinitu, rozdílnou hustotu, teplotu mrznutí a další fyzikální a chemické vlastnosti, které ji odlišují od sladké vody. Mořská voda je poměrně komplexní směsí různých látek, avšak jen některé z nich jsou v ní zastoupeny výrazněji, nejvýrazněji jsou zastoupeny anorganické soli, především chloridy, sírany a uhličitany. V oceánech a mořích má voda průměrnou salinitu kolem 3,5 % (tj. 35 gramů solí v litru mořské vody). Většina látek zastoupených v mořské vodě je v ní rozpuštěná, jak ukazuje tabulka 3.5., krom různých anorganických iontů jsou v mořské vodě rozpuštěné také plyny a organické látky.

Tab. 3.5. Látky rozpuštěné v mořské vodě (dle Libes, 2009, upraveno)

Kategorie

Hlavní prvky/ionty



Vedlejší ionty



Stopové prvky



Rozpuštěná organická hmota


Molekulární plyny


Koncentrace

> 50 mM

10 - 50 mM


0,1 - 10 mM

0,1 mM - 100 uM

1 - 100 nM

< 100 nM


ng.l-1 až mg.l-1



< mM


Příklady

Cl-, Na+

Mg2+, SO42-, Ca2+, K+


C , Br-, N2(g), B , O2(g)

Si, Sr2+, F-, NO3-, Li+, Ar(g), PO4-3, Rb+, I-, Ba2+


V, As, U, H+, Ne(g), Ni, Kr(g), Zn, Cr, Cu, He(g), Se, Sb, Al

Ti, Be2+, Mn, Fe, Co, Ga, Ge, Y, Z, Cd, Xe(g)


aminokyseliny, lipidy, humické látky, organokovové sloučeniny


CH4, CO2, CO, N2O, freon


Kromě rozpuštěných látek jsou ve vodě rozptýlené pevné částice, ať už organické zastoupené biomasou planktonu, fekálními peletami a dalšími částicemi spojenými s potravními sítěmi anebo látky anorganického původu (např. atmosférický spad, říční minerály, železité oxyhydroxidy apod.). Mimo tyto látky jsou v mořské vodě přítomné anorganické a organické koloidní látky.

Při iniciální kultivaci mořských sinic a řas je nejlepší udržovat kultury ve sterilní přírodní vodě z původní lokality, je však nutné hlídat kvalitu vody z odběrového místa, především kvůli riziku spojenému s činností člověka. Alternativními přístupy je využívání roztoků solí, které svým složením napodobují mořskou vodu (tzv. artificial seawater), nebo příprava umělé mořské vody z komerčně dodávaných akvaristických solí.

Při použití komerčně dodávaných akvaristických solí se osvědčila sůl vyráběná firmou Sera, která stabilizuje hodnotu pH ve správném rozmezí a velmi se svým složením podobá přírodní mořské soli. Její využití je poměrně univerzální, protože neobsahuje žádné dusičnany nebo fosforečnany, a proto může být využívána i při kultivaci oligotrofních organismů. Sbírka CCAP používá v některých ze svých médií komerční Ultramarine synthetica sea salt (výrobce Waterlife), obecně se dají využívat libovolné komerční akvaristické soli, ale je nutné hlídat jejich složení, především kvůli živinám (fosfor, dusík).

Ke sterilizaci přírodní mořské vody je možné využít filtraci – nejdříve je nutné odstranit organické látky přes aktivní uhlí promyté organickým rozpouštědlem (např. benzen, methanol, 50 % ethanol a následné důkladné promytí destilovanou vodou) a filtrace přes 0,45 μm filtry (zřídka se používají klasické 0,22 μm filtry). Filtrací sterilizovanou přírodní mořskou vodu lze skladovat nejlépe v neprůhledných plastových nádobách, případně nádobách ze skla. Další možností je sterilizace autoklávováním, která však přináší riziko vysrážení solí přítomných ve vodě. Existuje několik možností, jak toto riziko snížit, například rychlé zchlazení následující po autoklávování, vysoké koncentrace EDTA, přidání 1,44 ml 1N HCl a 0,12 g NaHCO3 na litr vody před autoklávováním. Dalšími možnostmi sterilizace přírodní mořské vody je klasická pasterizace (propařování) anebo sterilizace malých objemů v mikrovlnné troubě.

V následujícím přehledu kultivačních médií jsou uvedena jen některá, běžně používaná média, určená pro různé druhy mořských sinic a řas. Detaily o běžných a speciálních mořských kultivačních médií uvádí Andersen et al. (2005). Porovnání složení některých z těchto médií je uvedeno v Tabulce 3.6.

  • Aquil médium je médium primárně určené pro experimenty spojené s limitací stopovými prvky, nepatří ke zcela rutinně užívaným médiím pro dlouhodobé udržování kultur, má především experimentální charakter. Médium se připravuje z ultračisté vody (např. Mili-Q water) a sterilizuje se v mikrovlnné troubě nebo filtrací, aby se předešlo kontaminaci kovy z autoklávu (Sunde et al., 2005).

  • ASP-2 je jedno z médií, které bylo navrženo Provasoli et al. (1957), které se používá pro udržování mořského planktonu, například obrněnek, zelených bičíkovců apod. Může být modifikováno přidáním dalšího pufru NTA (kyselina nitrilotrioctová), další modifikace ASP-M je založena na využití jiných stopových prvků a vitamínů se používá pro kultivaci makrořas i mikroskopických řas.

  • ES médium je médium připravené obohacením přírodní mořské vody o dusičnany, fosforečnany, pufry, stopové prvky a vitamíny. Pro fytoplankton otevřeného oceánu je designováno médium ESAW připravené modifikací ES média (nahrazení přírodní mořské vody umělou).

  • ASN-IIII médium je médium určené pro mořské sinice.

  • YBC-II médium bylo určeno pro fyziologické studie dusík fixující mořské sinice Trichodesmium a neobsahuje v sobě žádné dusíkaté látky.

  • f/2 médium je běžné a rozšířené médium využívané pro příbřežní mořské řasy, především rozsivky. Původní receptura je založená na obohacení přírodní mořské vody, lze ji však připravovat i s umělou mořskou vodou. Modifikací s vyšším obsahem stopových prvků se připravuje L1 médium, které je opět použitelné pro většinu příbřežních řas.

  • K médium je určené pro oligotrofní (oceánický) mořský plankton, obsahuje 10krát vyšší množství chelátoru (EDTA) a tím redukuje dostupnost stopových prvků. Připravuje se z přírodní mořské vody přídavkem solí, původní recept uvádí použití umělé mořské vody.

  • MNK médium je speciální médium určené pro kultivaci řas ze skupiny Coccolithophores (Haptophyta), ale dá se používat jako univerzální médium pro mořský fytoplankton. Na přípravu je náročnější než ostatní média, připravuje se z přírodní oligotrofní mořské vody.

  • PC médium je médium založené na obohacení mořské vodě, určení pro kultivaci rodu Prochlorococcus, může být použité i pro další zástupce mořského planktonu. Připravuje se z oligotrofní mořské vody. Podobně je pro kultivace Prochloroccus určené médium Pro99.

  • SN médium je speciální médium určené ke kultivaci rodu Synechococcus, má vysoký obsah dusíku. Připravuje se přidáním sterilních zásobních roztoků do sterilní přírodní mořské vody.

Existují také varianty obohacených mořských médií s přídavkem organických látek, např. Antia’s médium s přídavkem glycerinu pro pěstování heterotrofních skrytěnek nebo obohacená média s přídavkem půdního extraktu, např. Plymouth Erd-Schreiber médium, které je použitelné pro kultivaci mnoha druhů mořských řas, podobně široce použitelné je General Purpose médium (GPM), které bylo primárně určené pro pěstování mořských obrněnek.