ALGOLOGICKÉ KULTIVAČNÍ TECHNIKY

Kultivační média

Kultivační média (někdy též živné půdy nebo růstová média) poskytují výživu a další vhodné podmínky organismům, které jsou na nich pěstovány a obecně platí, že čím složitější je organismus, tím komplexnější je potřebné médium. Média můžeme jednoduše dělit na tekutá, pevná (ztužená agarem v koncentraci 1,25 – 2 %) nebo bifázická – pevná složka zalitá tekutou složkou. Kultivační médium by mělo co nejvíce odpovídat podmínkám prostředí, ze kterého zájmový organismus pochází, existuje řada běžných kultivačních médií, případně mírně modifikovaných, rutinně využívaných v běžných laboratořích, ale i sbírkách. Druhou část představují média speciální, designována přímo pro daný organismus nebo média využívaná v biotechnologii. Média se dělí jednoduše na média připravená z přírodní vody (viz Kapitola 3.3.), syntetická/umělá média pro sladkovodní nebo mořské sinice a řasy (viz Kapitoly 3.4. a 3.5.); zvláštní kapitolu tvoří média založená na půdě jako hlavním zdroji živin (viz Kapitola 3.6.), která se buď používají jako samostatná, často bifázická, nebo jako přídavek do ostatních médií.

Pro výběr a přípravu vhodného média platí několik důležitých pravidel (Grobbelaar, 2013): (1) celkový obsah solí by měl být určený původním prostředím řasy a musí obsahovat odpovídající a využitelný (2) zdroj dusíku - dusičnany, amoniak, příp. močovina, (3) zdroj uhlíku (plynné CO2, CO32-, HCO3-), (4) zdroj fosforu (nejčastěji ve formě PO43-), (5) základní ionty: K+, Mg2+,Na+, Ca2+, SO42-, Cl a (6) stopové prvky[1] a chelatační činidlo, (6) upravit odpovídajícím způsobem pH a (8) přidat vitamíny, pokud to řasy vyžadují, případně jiné látky.

---

[1] Stopové prvky (trace metals) jsou v návodech na přípravu médií často označovány jako mikroprvky, především z důvodu zjednodušování. Terminologie spojená s makro- a mikroprvky a stopovými prvky se liší také napříč obory.

Výživa sinic a řas

Sinice a řasy představují v naprosté většině fotoautotrofní organismy, využívající světelného (slunečního) záření jako energie a oxidu uhličitého jako zdroje uhlíku a produkují sacharidy a energii (jako ATP). Existují však mnohé výjimky od tohoto “rostlinného standardu”, kdy mohou řasy získávat uhlík ve formě organických látek – heterotrofní řasy – a to příjmem rozpuštěných organických látek (osmotrofie) a nebo pohlcováním jiných buněk jako například bakterie nebo jiné řasy, pak se jedná o fagotrofii. Některé řasy jsou schopné kombinovat svou auto- a heterotrofii, takovéto řasy jsou označovány jako mixotrofní, míra mixotrofie může být velmi variabilní, některé mixotrofní řasy jsou převážně fotoautotrofní a heterotrofně se živí jen příležitostně. Mixotrofie je vhodná v prostředích, kde může dojít ke vzniku limitace ať už v podobě hlavních makroprvků či železa, nebo látek důležitých pro růst (např. vitamíny, esenciální aminokyseliny…). Z hlediska mixotrofní výživy můžeme řasy dělit do následujících skupin: obligátně heterotrofní řasy - primárně heterotrofní, ale jsou schopny fototrofie pokud jsou limitovány nedostatkem potravy (např. obrněnky Gymnodinium gracilentum); obligátně autotrofní řasy - primárně se jedná o autotrofní organismy, ale mohou využívat fagotrofie a/nebo osmotrofie v případě, kdy vzniká limitace světlem (např. zlativka Dinobryon divergens); fakultativně mixotrofní řasy - v jejich životním cyklu jsou stejnou měrou zastoupeny fototrofie i heterotrofie (např. obrněnka Fragilidium subglobosum); obligátně mixotrofní řasy - jejich primární strategií je fototrofie, ale fagotrofie a/nebo osmotrofie jim zajišťuje esenciální sloučeniny pro jejich růst (např. krásnoočko Euglena gracilis) (Barsanti & Gualtieri, 2014).

Obr. 3.1. Variabilita v typech výživy (podle Grobbelaar, 2011, upraveno).

Pro řádné fungování metabolismu vyžadují sinice a řasy udržované v kulturách základní makro-, mikroprvky a stopové prvky. Makroprvky (makrobiogenní prvky, zastoupení v desítkách procent) představují základní stavební kameny téměř všech molekul důležitých pro správnou funkci organismu. Mezi makroprvky řadíme uhlík, kyslík, vodík, dusík, vápník a fosfor. Z předchozího textu o pravidel při používání kultivačních médií je zřejmé, že je důležité zajistit zdroje uhlíku, fosforu a dusíku a stejně tak chápat metabolismus těchto prvků ve fyziologii mikroskopických řas. Mikroprvky (mikrobiogenní, oligobiogenní prvky, zastoupení do 1 %) a stopové prvky (zastoupení do 0,001 %), jejichž zastoupení je v živé hmotě procentuálně výrazně nižší než případě makroprvků, jsou však stále zásadní fyziologii a biochemické procesy, přehled základních funkcí těchto dvou skupin prvků je uvedený v tabulce 3.1.

Tab 3.1. Přehled makro- (M), mikroprvků (m) a stopových prvků (s) důležitých pro sinice a řasy (Graham et al., 2009, upraveno)

Uhlík představuje zásadní prvek pro fotosyntézu, v přírodě je zastoupen jako plynný oxid uhličitý a současně v množství anorganických a organických sloučenin. Oxidu uhličitý, využívaný pro fotosyntézu suchozemskými rostlinami proniká do vody difúzně mnohem pomaleji, nepokryje jeho spotřebu vodními fotosyntetickými organismy, a proto jsou těmito organismy využívány jeho rozpuštěné anorganické formy – hydrogenuhličitany (-HCO3-), uhličitany (-CO3-2) se jako zdroj uhlíku neuplatňují (Beardall & Raven, 2016, Grobbelaar 2013). V případě potřeby může být sinicím a řasám dodáván probubláváním kultur vzduchem obohaceným o oxid uhličitý. Dusík se v přírodě vyskytuje jak ve své biatomární formě, tak v širokém spektru anorganických a organických sloučenin. Sinicemi a řasami je dusík přijímám nejčastěji ve formě amonných iontů (NH4+), dusičnanů (NO3-) nebo dusitanů (NO2-), z organických forem mohou být využívány například aminokyseliny nebo močovina [diamid kyseliny uhličité, CO(NH2)2] (Raven & Giordano, 2016), některé sinice jsou schopny fixace atmosférického dusíku (N2) pomocí speciálních buněk – heterocytů a diazocytů. Další makroprvek – fosfor – je sinicemi a řasami přijímán především ve formě fosforečnanů (ortofosforečnany, -PO4-3), v současné době se zjišťuje, že kromě běžné anorganické formy fosforu, považované za nejlépe biologicky využitelnou formu, mohou důležitou roli hrát také organické sloučeniny (Dyhrman, 2016, Grobbelaar 2013). V některých kultivačních médiích se využívá β-glycerofosfát disodný (C3H7Na2O6P . 5H2O), jednoduchý donor organických fosfátů. O mechanismech příjmu a funkci těchto makroprvků se zmiňuje kapitola 10.1.

Stopové prvky jsou důležité pro růst řas a často jsou součástí esenciálních organických sloučenin, zejména koenzymů, které vstupují do fotosyntetických reakcí. Jedná se především o železo, mangan, zinek, měď, kobalt nebo molybden (Barsanti & Gualtieri, 2014). Tyto stopové prvky jsou často limitujícími v přírodních vodách, například železo, zinek a mangan jsou vyžadovány rozsivkami jak z příbřežních oblastí, tak volného oceánu; kobalt a železo pak vyžadují pro svůj růst sinice Synechococcus bacillaris vyskytující se v příbřežní oblasti nebo oceánický zástupce Haptophyta Emiliania huxleyi. Z výše uvedeného výčtu je patrné, že většina uvedených prvků představuje toxické kovy, tyto kovy působí v nízkých koncentracích pozitivně na růst sinic a řas, v nadbytku však mají účinek inhibiční a často působí jako antagonisté jiným prvkům, například nadbytek mědi, kadmia nebo zinku může způsobit inhibici růstu zamezením příjmu manganu do buňky (Sunda et al., 2005). Pochopení funkce a metabolismu jednotlivých stopových prvků je zásadní v případě designování nových nebo modifikaci existujících kultivačních médií.

Ze stopových prvků je asi nejdůležitějším prvkem železo, které hraje roli v zásadních fyziologických procesech spojených s fotosyntézou, asimilací dusíku, buněčným dýcháním a dalšími pochody. V přírodě se železo vyskytuje vázané především ve svých dvou formách Fe+2 a Fe3+. V přírodních vodách má poměrně komplexní chemismus spojený s různými formami železa, rozpustné i nerozpustné anorganické formy, koloidní formy nebo organické sloučeniny obsahující železo (Marchetti & Maldonato, 2016). Z jeho zásadního postavení v metabolismus vychází také jeho esenciálnost v kultivačních médiích, často v chelatované formě.

Zvláštní postavení mezi prvky důležitými pro řasy má selen, který není v kontextu sinic a řas chápán jako biogenní prvek, avšak jeho přítomnost v prostředí se zdá být pro mnohé skupiny poměrně zásadní. Závislost růstu na přítomnosti selenu v prostředí nebo kultivačním médiu vykazují především mořské planktonní řasy, ilustrační přehled některých skupin a příklady jednotlivých organismů shrnuje tabulka 3.2. Selen se v přírodě vyskytuje v elementární formě (S0), formě selenidů (-Se2-), seleničitanů (-SeO32-) a selenanů (-SeO4-2), vzhledem k tomu, že patří mezi chalkogeny, stejně jako síra, může, díky analogickým fyzikálním a chemickým vlastnostem, síru nahradit v některých sloučeninách. V buňkách je přítomen v tzv. selenoproteinech, které představují fyziologicky aktivní molekulární formu tohoto prvku v živých buňkách, hlavní biologickou formou selenu je pak selenocystein, analog aminokyseliny cysteinu (Araie & Shiraiwa, 2016), tím lze do jisté míry vysvětlovat jeho esencialitu pro některé skupiny řas, především pro ty, které získaly svoje chloroplasty sekundární endosymbiózou s plastidy odvozenými od ruduchy.

Tab. 3.2. Zástupci mořského fytoplanktonu, kteří pro svůj růst vyžadují selen (Araie & Shiraiwa 2009, upraveno).

Ve spojení s řasami je také důležité zmínit tzv. auxotrofii, tedy neschopnost organismu syntetizovat určitou látku potřebnou pro jeho růst. Těchto látek je poměrně široké spektrum a zahrnují například pro živočichy důležité esenciální aminokyseliny a mastné kyseliny, které musejí přijímat v potravě, v případě řas jsou touto látkou nejčastěji vitamíny. Typickou řasovou skupinou spojovanou s auxotrofií jsou zlativky (Chromophyta, Chrysophyceae sensu lato). Nutnost vitamínů pro řasy ukazuje práce Croft et al., 2006, kteří studovali 306 druhů řas napříč systémem a jejich výsledky ukazují poměrně výraznou auxotrofii ve spojení s vitamíny (viz Tab. 3.3.). Z vitamínů důležitých pro růst mnoha auxotrofních řas jsou nejvýznamnější – vitamin B1 (thiamin, Obr. 3.3.), vitamin B7 (biotin, Obr. 3.2.) a vitamín B12 (kobalamin, Obr. 3.4.).

Tab. 3.3. Požadavek na vitamíny u jednotlivých druhů v rámci hlavních skupin řas (dle Croft et al., 2006)

Obr. 3.2. Struktura biotinu – vitamin B7 (zdroj Wikipedia).

Obr. 3.3. Struktura thiaminu – vitamin B1 (zdroj Wikipedia).

Obr. 3.4. Struktura kobalaminu – vitamin B12 (zdroj Wikipedia).

Chelatační činidla a pufry

Součástí většiny médií jsou různě komplexní roztoky obsahující stopové prvky, které jsou důležité pro správné biologické funkce kultivovaných organismů (viz. Tab. 3.1.), dále většina médií obsahuje rozličná chelatační činidla, která hrají důležitou roli v metabolismu jednotlivých stopových prvků. Některá média navíc obsahují pufry, jejichž hlavní funkcí je udržovat stabilní pH.

Chelatační činidla (chelátory) mají schopnost navázání (chelatace) dvou nebo vícevazebného ligandu, nejčastěji se jedná o vazbu organické sloučeniny na kov, případně jiný kationt (viz Obr. 3.5.). Chelatační činidlo zlepšuje příjem minerálních látek – především stopových prvků – organismem, tento příjem je mnohem efektivnější než příjem minerální formy.

Chelatační činidla v nízké koncentraci zlepšují dostupnost stopových prvků pro sinice a řasy a současně fungují jako pufrovací systém, který udržuje víceméně konstantní koncentrace volných kovových iontů. V přírodní mořské vodě fungují rozpuštěné organické látky jako chelátory, které eliminují vliv toxických prvků, například mědi, a současně zamezují vysrážení a sedimentaci některý prvků, například železa, a snižují jejich potenciální nedostupnost pro sinice a řasy (Barsanti & Gualtieri, 2014).

Obr. 3.5. Metal-EDTA chelát (zdroj Wikipedia)

Nejčastěji používaným chelátorem je kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA, Obr. 3.7.), případně její disodná sůl. V kultivačních médiích se koncentrace EDTA poměrně liší, poměr chelátor:kov může být od 1:1 (např. f/2 médium) až po 10:1 (K médium). Dalším často užívaných chelátorem je kyselina nitrilotrioctová (NTA, Obr. 3.6.). Vlastnosti těchto látek shrnuje tabulka 3.3.

Obr. 3.6. Struktura Chelatonu 1 – kyselina nitrilotrioctová (zdroj Wikipedia)

Obr. 3.7. Struktura Chelatonu 2 – kyselina ethylendiamintetraoctová (zdroj Wikipedia)

Tab. 3.3. Přehled vlastností nejběžněji používaných chelatačních činidel

Sloučenina (používaná zkratka)

kyselina nitrilotrioctová (NTA), Obr. 3.6.


kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA), Obr. 3.7.


disodná sůl kyseliny ethylendiamintetraethanové (Na2-EDTA)


Sumární vzorec

C6H9NO6


C₁₀H₁₆N₂O₈


C10H14N2Na2O8. 2H2O


Molární hmotnost

191,1 g.mol-1


292,25 g.mol-1


372,24 g.mol-1


Triviální názvy

Chelaton I


edetová kyselina
Chelaton II
Komplexon II


Chelaton III

Komplexon III


Většina návodů na přípravu kultivačních médií uvádí pH výsledného roztoku, většinou před vlastním autoklávováním. Přestože je pH jednotlivých kultivačních médií poměrně důležitým parametrem, ve většině případů mu není věnována pozornost. Pro rutinní práci v laboratořích není nutné upravovat pH tak, aby dosahovalo hodnot uvedených v návodu na přípravu, ale je dobré čas od času pH měřit, aby měl uživatel tušení, v jakém rozmezí se jím používané médium pohybuje. K úpravám pH se používají různé koncentrace (viz Box 2.2.) kyselin, nejčastěji kyselina chlorovodíková nebo kyselina sírová, nebo hydroxidů, nejčastěji hydroxid draselný.

Box 3.1. Normalita vs. molarita

Molární koncentrace (molarita nebo látková koncentrace) je vyjádření množství molů určité látky v celkovém objemu směsi, c=n_a/V=m_a/(M_a∙V), kde na je látkové množství, Ma molární hmotnost a ma hmotnost složky a, V je celkový objem roztoku. Normalita udává počet chemických ekvivalentů v jednom litru roztoku; chemický ekvivalent je část molekuly při dané reakci ekvivalentní jednomu protonu (neutralizační reakce) nebo jednomu elektronu (redoxní reakce), c_A=c∙v, kde cA je normální koncentrace, c je molární koncentrace, v je počet protonů (elektronů), s nimiž reaguje jedna molekula nebo iont. Dnes se již tato koncentrace běžně nepoužívá.

Příklady: 1 M HCl = 1 N HCl, 1 M H2SO4 = 2 N H2SO4, 1 M H3PO4 = 3 N H3PO4


Biologické systémy jsou náchylné na změny pH, které mívají dopad na jejich fyziologii nebo životaschopnost obecně – na pH závisí především vlastnosti bílkovin, ale i jiných důležitých molekul. Hodnota pH běžných kultivačních médií se pohybuje v rozmezí mezi 6 - 8, které je poměrně optimální pro udržování kultur. Jiná situace je v médiích, které v sobě obsahují pufr. Pufr představuje konjugovaný pár kyseliny (nebo zásady), který je schopný udržovat stabilní pH v určitém poměrně úzkém rozmezí. Hodnota pH pufru závisí na jeho disociační konstantě (pKa) a lze jej vypočítat podle Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice: pH = pKa + log [A-]/[HA], kde [A-] je koncentrace kyseliny a [HA] je koncentrace kyseliny, z tohoto vyplývá, že pufr nejlépe funguje, pokud je pH = pK +/- 1. To, jak je daný pufr účinný, je dáno pufrační kapacitou, definovanou poměrem přídavku silné zásady, resp. silné kyseliny k příslušné změně pH pufru, pufrační kapacita je maximální, pokud je koncentrace obou konjugovaných složek pufru stejná, tzn. pH = pK pufru. Ve většině kultivačních médií jsou již jasně definovány koncentrace pufru, nejčastěji přidávaného v sypké formě spolu s informací, na jakou hodnotu má být pH výsledného média upraveno. Nejčastěji využívanými pufry jsou TRIS, HEPES a MES, jejich základní vlastnosti jsou uvedeny v Tabulce 3.4.

Tab. 3.4. Přehled vlastností nejběžněji používaných pufrů.

Sloučenina (triviální názvy)

tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS, Tris bas, TrizmaT, Trisamine, THAM)

kyselina 2-(N-morfolino)-ethansulfonová (MES)


N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonová kyselina
(HEPES)


Sumární vzorec


C4H11NO3


C6H13NO4S



C8H18N2O4S


Molární hmotnost


121,14 g.mol-1



195,20 g.mol-1




238,31 g.mol-1


Vlastnosti

pKa = 8,07 (25°C)

pH 7,1 - 9,1


pKa = 6,10 (25°C)

pH 5,5 - 6,7


pKa1 = 3 (25°C)

pKa2 = 7,5 (25°C)

pH 2,5 - 3,5; 6,8 - 8,2